WGBS+RNA-seq助力揭示植物不定根再生的DNA甲基化調(diào)控機(jī)制

瀏覽次數(shù)：270　發(fā)布日期：2025-7-24　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

植物由于不能移動(dòng)，會(huì)受諸如風(fēng)、雪和動(dòng)物等逆境脅迫，這些脅迫可能會(huì)破壞植物結(jié)構(gòu)，因此再生能力對(duì)于植物生存至關(guān)重要。近日，北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院李云教授團(tuán)隊(duì)探索了植物刺槐（Robinia pseudoacacia L.）的不定根（Adventitious Roots, ARs）再生過程中DNA低甲基化（Hypomethylation）對(duì)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的作用。研究通過使用DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷（5-azacytidine, 5-azaC）處理刺槐下胚軸切段，通過全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（Whole-Genome Bisulfite Sequencing, WGBS）和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)，揭示了低甲基化激活以RpMYB2為中心的基因網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而顯著增強(qiáng)不定根再生能力。相關(guān)研究成果以《DNA Hypomethylation Activates the RpMYB2-Centred Gene Network to Enhance Regeneration of Adventitious Roots》為題發(fā)表于《Plant Cell Environ》期刊。

標(biāo)題：DNA Hypomethylation Activates the RpMYB2-Centred Gene Network to Enhance Regeneration of Adventitious Roots（DNA低甲基化激活以RpMYB2為中心的基因網(wǎng)絡(luò)，以增強(qiáng)不定根再生）
發(fā)表時(shí)間：2025年2月
發(fā)表期刊：Plant Cell Environ
影響因子：IF6.3/Q1
技術(shù)平臺(tái)：WGBS、RNA-seq
作者單位：北京林業(yè)大學(xué)李云等
DOI：10.1111/pce.15236

本研究利用5-azaC DNA甲基化抑制劑，使根原基的啟動(dòng)和發(fā)育更早發(fā)生，從而提高刺槐的不定根再生率。WGBS揭示了在5-azaC處理樣本中，整體甲基化水平下降，而在所有背景（包括CHH、CHG和mergedCG）中，低甲基化胞嘧啶位點(diǎn)和區(qū)域增加，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄變異。酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）實(shí)驗(yàn)揭示了一個(gè)以RpMYB2為中心的轉(zhuǎn)錄因子（Transcription Factors, TFs）網(wǎng)絡(luò)，這些轉(zhuǎn)錄因子被RpWRKY23、RpGATA23、RpSPL16以及其他基因如RpSDP、RpSS1、RpBEN1、RpGULL05和RpCUV轉(zhuǎn)錄激活，其核定位表明它們可能共定位。酵母單雜交（Yeast One-Hybrid, Y1H）實(shí)驗(yàn)揭示RpMYB2互作蛋白R(shí)pGATA23、RpWRKY23與RpSK6、RpCDC48的啟動(dòng)子互作，而熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（Luciferase Reporting Assay, LRA）驗(yàn)證了其與RpSK6結(jié)合。本研究結(jié)果表明，低甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組修飾激活了以RpMYB2為中心的基因網(wǎng)絡(luò)，從而增強(qiáng)了刺槐下胚軸切段的不定根再生能力。這些發(fā)現(xiàn)為通過遺傳改良提高植物再生能力和增加木材產(chǎn)量，同時(shí)抵御環(huán)境損害提供了理論基礎(chǔ)。

研究方法

植物材料收集與再生：使用刺槐種子萌發(fā)后的下胚軸切段作為實(shí)驗(yàn)材料，分別在含和不含5-azaC的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察不定根再生情況。
石蠟切片與解剖分析：對(duì)處理和未處理的切段進(jìn)行石蠟切片，觀察不定根原基的啟動(dòng)和發(fā)育過程。
WGBS分析：分析全基因組范圍內(nèi)的DNA甲基化水平。
RNA-seq分析：分析基因表達(dá)差異。
實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證：對(duì)RNA-seq結(jié)果中差異表達(dá)的基因進(jìn)行驗(yàn)證。
酵母雙雜交（Y2H）和酵母單雜交（Y1H）實(shí)驗(yàn)：鑒定與RpMYB2互作蛋白，以及這些蛋白與下游基因啟動(dòng)子的結(jié)合情況。
熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（LRA）：驗(yàn)證特定轉(zhuǎn)錄因子與目標(biāo)基因啟動(dòng)子的結(jié)合。
亞細(xì)胞定位分析：通過共聚焦顯微鏡觀察關(guān)鍵蛋白在細(xì)胞中的定位。

結(jié)果圖形
（1）不定根原基的啟動(dòng)與發(fā)育
研究通過石蠟切片觀察了5-azaC處理和未處理切段的不定根原基啟動(dòng)和發(fā)育過程。從8日齡幼苗的下胚軸切取1cm長(zhǎng)的切段作為外植體，并在切割后的五個(gè)時(shí)間點(diǎn)（包括切割后的第0天、第1天、第2天、第3天和第4天，分別標(biāo)記為D0、D1、D2、D3和D4）進(jìn)行橫截面分析。通過在不同時(shí)間點(diǎn)的組織學(xué)對(duì)比區(qū)分對(duì)照組（D1C、D2C、D3C、D4C）和5-azaC處理組（D1T、D2T、D3T、D4T）外植體中原基的發(fā)育進(jìn)程以及根分生組織的增殖情況。結(jié)果顯示，5-azaC處理顯著加速了不定根原基的啟動(dòng)和發(fā)育，處理組在第4天即可觀察到不定根的形成，而對(duì)照組則未能發(fā)育出完整的不定根（圖1）。這表明5-azaC通過促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化，顯著增強(qiáng)了不定根的再生能力。

圖1：不定根形成及橫切切段的解剖學(xué)研究。

(a) 1cm長(zhǎng)的下胚軸切段放置在含和不含5-azaC培養(yǎng)基上的形態(tài)學(xué)特征。
(b) 每段不定根數(shù)量。
(c) 下胚軸切段的解剖結(jié)構(gòu)顯示了不定根原基的啟動(dòng)和發(fā)育。與對(duì)照組相比，處理組（D2T）的不定根原基啟動(dòng)更早。在（D3T）中形成了根冠，而在（D4T）中原基發(fā)展為功能性不定根，但在（D3C，D4C）中，根分生組織未能發(fā)育。

（2）全基因組甲基化圖譜與不定根再生能力
通過WGBS分析，研究發(fā)現(xiàn)5-azaC處理顯著降低了基因組整體甲基化水平，尤其是在CHH、CHG和mergedCG三種序列背景下。在基因組的不同區(qū)域（包括啟動(dòng)子、基因體和終止子下游區(qū)域），處理組的甲基化水平均顯著低于對(duì)照組，尤其是在CHH背景下，甲基化水平降低更為顯著（圖2a-c）。這表明低甲基化可能通過影響基因表達(dá)調(diào)控來增強(qiáng)不定根的再生能力。

圖2：5-azaC處理介導(dǎo)全基因組低甲基化。

在5-azaC處理和對(duì)照樣本中，第2天和第4天的基因及其±2kb區(qū)域CHH背景（a）、CHG背景（b）和mergedCG背景（c）中的DNA甲基化水平變化。在CHH背景（d）、CGH背景（e）和mergedCG背景（f）中，不同基因組元件（包括啟動(dòng)子、外顯子、5′UTR和3′UTR）中高甲基化和低甲基化差異甲基化位點(diǎn)（DMCs）數(shù)量。在CHH背景（g）、CGH背景（h）和mergedCG背景（i）中，不同基因組元件（包括啟動(dòng)子、外顯子、5′UTR和3′UTR）中高甲基化和低甲基化差異甲基化區(qū)域（DMRs）數(shù)量。

（3）低甲基化位點(diǎn)和區(qū)域激活與不定根再生相關(guān)的基因
研究通過分析差異甲基化位點(diǎn)（DMCs）和差異甲基化區(qū)域（DMRs），發(fā)現(xiàn)5-azaC處理顯著增加了基因調(diào)控區(qū)域的低甲基化位點(diǎn)和區(qū)域數(shù)量。特別是在啟動(dòng)子區(qū)域，低甲基化的DMCs和DMRs數(shù)量顯著多于高甲基化的情況（圖2d-i）。這些低甲基化位點(diǎn)和區(qū)域與不定根再生相關(guān)的基因表達(dá)激活密切相關(guān)，如RpMYB2、RpWRKY23等基因在低甲基化后表達(dá)顯著上調(diào)。

（4）轉(zhuǎn)錄組分析鑒定5-azaC處理激活的基因及低甲基化RpMYB2的潛在互作因子
RNA-seq分析顯示，5-azaC處理顯著改變了基因表達(dá)譜，特別是在處理4天后，差異表達(dá)基因數(shù)量顯著增加。這些差異表達(dá)基因主要包括細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程（圖3）。其中，低甲基化激活的基因如RpMYB2、RpWRKY23等在不定根再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，且這些基因可能通過與其他基因互作來調(diào)控不定根再生。

圖3：DNA低甲基化導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄組變化，從而引起基因差異表達(dá)。

火山圖展示了D2C與D2T組（a）以及D4C與D4T組（b）之間的差異表達(dá)基因（DEGs）。熱圖描繪了D2C與D2T組（c）以及D4C與D4T組（d）之間的差異表達(dá)基因。所選上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因的相對(duì)表達(dá)量（e）。

（5）酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)揭示低甲基化RpMYB2在增強(qiáng)生根能力的基因互作網(wǎng)絡(luò)中的中心地位
酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低甲基化激活的RpMYB2是基因互作網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)，與多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和功能蛋白相互作用，如RpGATA23、RpWRKY23、RpSDP等（圖4）。這些相互作用蛋白在不定根再生過程中發(fā)揮協(xié)同作用，調(diào)控細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。

圖4：通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白-蛋白互作。展示RpMYB2和RpSDP蛋白與其他蛋白的正向互作。

（6）酵母單雜交實(shí)驗(yàn)揭示以RpMYB2為中心的基因網(wǎng)絡(luò)的進(jìn)一步見解）
酵母單雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了RpMYB2互作蛋白與下游基因啟動(dòng)子的結(jié)合情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RpWRKY23和RpGATA23能夠與RpSK6和RpCDC48的啟動(dòng)子結(jié)合，表明這些轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控下游基因的表達(dá)來增強(qiáng)不定根的再生能力（圖5A）。

圖5：通過酵母單雜交和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析DNA-蛋白互作。

酵母單雜交（Y1H）展示了不同轉(zhuǎn)錄因子與RpSK6和RpCDC48啟動(dòng)子之間的相互作用。
熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示轉(zhuǎn)錄因子RpWRKY23和RpGATA23與RpSK6啟動(dòng)子的相互作用。

（7）熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證RpWRKY23和RpGATA23蛋白與RpSK6啟動(dòng)子的互作
熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了酵母單雜交實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)，即RpWRKY23和RpGATA23能夠與RpSK6的啟動(dòng)子結(jié)合并激活其表達(dá)（圖5B）。這表明這些轉(zhuǎn)錄因子在不定根再生過程中通過調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)發(fā)揮重要作用。

（8）亞細(xì)胞定位分析揭示以RpMYB2為中心的互作網(wǎng)絡(luò)中蛋白的亞細(xì)胞定位
亞細(xì)胞定位分析顯示，RpMYB2及其互作蛋白主要定位于細(xì)胞核，部分蛋白如RpSDP和RpWRKY23還定位于細(xì)胞質(zhì)膜（圖6）。這表明這些蛋白在細(xì)胞核內(nèi)與其他基因相互作用，調(diào)控基因表達(dá)，同時(shí)也可能參與細(xì)胞質(zhì)膜相關(guān)的生物學(xué)過程。

圖6：RpMYB2互作蛋白的亞細(xì)胞定位。共聚焦激光掃描顯微鏡圖像顯示了用GFP標(biāo)記的蛋白的細(xì)胞內(nèi)分布。所有研究的蛋白主要定位于細(xì)胞核。RpMYB2、RpSDP和RpWRKY23還顯示出在質(zhì)膜定位。

結(jié)論和啟示
本研究通過WGBS和RNA-seq技術(shù)揭示了DNA低甲基化在刺槐不定根再生中的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，5-azaC處理通過降低基因組整體甲基化水平，激活了以RpMYB2為中心的基因網(wǎng)絡(luò)，顯著增強(qiáng)了不定根的再生能力。這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解植物再生的分子機(jī)制提供了新的視角，還為通過遺傳改良提高植物再生能力和適應(yīng)環(huán)境脅迫提供了潛在的靶點(diǎn)。

WGBS和RNA-seq技術(shù)在解析植物表觀遺傳調(diào)控中的重要作用
WGBS和RNA-Seq的聯(lián)合應(yīng)用，研究者能夠從表觀遺傳修飾和基因表達(dá)兩個(gè)層面，全面解析DNA低甲基化在不定根再生中的調(diào)控機(jī)制。通過整合分析，研究者發(fā)現(xiàn)低甲基化位點(diǎn)和區(qū)域的變化直接導(dǎo)致了相關(guān)基因表達(dá)的激活，從而促進(jìn)了不定根的再生。這種協(xié)同分析不僅揭示了DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用，還為理解植物再生過程中的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制提供了新的視角。

關(guān)于易基因全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）
全基因組重亞硫酸鹽甲基化測(cè)序（WGBS）可以在全基因組范圍內(nèi)精確的檢測(cè)所有單個(gè)胞嘧啶堿基（C堿基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金標(biāo)準(zhǔn)。WGBS能為基因組DNA甲基化時(shí)空特異性修飾的研究提供重要技術(shù)支持，能廣泛應(yīng)用在個(gè)體發(fā)育、衰老和疾病等生命過程的機(jī)制研究中，也是各物種甲基化圖譜研究的首選方法。

易基因全基因組甲基化測(cè)序技術(shù)通過T4-DNA連接酶，在超聲波打斷基因組DNA片段的兩端連接接頭序列，連接產(chǎn)物通過重亞硫酸鹽處理將未甲基化修飾的胞嘧啶C轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏，進(jìn)而通過接頭序列介導(dǎo)的 PCR 技術(shù)將尿嘧啶U轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏。

應(yīng)用方向：
WGBS廣泛用于各種物種，要求全基因組掃描（不錯(cuò)過關(guān)鍵位點(diǎn)）

全基因組甲基化圖譜課題
標(biāo)志物篩選課題
小規(guī)模研究課題

技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

應(yīng)用范圍廣：適用于所有參考基因組已知物種的甲基化研究；
全基因組覆蓋：最大限度地獲取完整的全基因組甲基化信息，精確繪制甲基化圖譜；
單堿基分辨率：可精確分析每一個(gè)C堿基的甲基化狀態(tài)。

參考文獻(xiàn)：
Hussain SS, Li Y, Liu J, Abbas M, Li Q, Deng H, Abbas S, Han K, Han J, Sun Y, Li Y. DNA Hypomethylation Activates the RpMYB2-Centred Gene Network to Enhance Regeneration of Adventitious Roots. Plant Cell Environ. 2024 Oct 28. doi: 10.1111/pce.15236.

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