AAV-DJ/8試劑對肝臟的感染效率的影響
Hippo-YAP信號傳導對器官發(fā)育和腫瘤發(fā)生至關(guān)重要，YAP-VGLL4拮抗作用被證實參與調(diào)節(jié)YAP在不同器官之間的生理功能，但是這種拮抗作用的調(diào)節(jié)機制，特別是VGLL4的真正E3連接酶，仍然是未知的。近期南昌大學第一附屬醫(yī)院趙冰教授團隊聯(lián)合復旦大學焦石教授團隊在Nature Chemical Biology (IF 13.7)上發(fā)表文章“Nuclear ubiquitination permits Hippo–YAP signal for liver development and tumorigenesis”，發(fā)現(xiàn)UBR5作為Hippo-YAP信號通路的核E3連接酶，通過靶向YAP拮抗劑VGLL4，在器官發(fā)育和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
· 維真助力 - AAV·
病毒產(chǎn)品：AAV-DJ/8-Ttr-Cre
注射方式：尾靜脈注射
病毒用量：5 × 10^11 GC
結(jié)果展示
1. 核泛素化允許Hippo-Yap信號傳導
作者使用Ub激活酶抑制劑（TAK-243）評估了整體泛素化對關(guān)鍵核轉(zhuǎn)導信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)TAK-243處理后Hippo-YAP信號傳導受到抑制，抑制細胞質(zhì)泛素化應(yīng)該具有相反的效果，因此作者推斷核泛素化可能是Hippo-YAP信號傳導的決定因素。作者進一步篩選了調(diào)節(jié)Hippo-YAP信號傳導的潛在E3連接酶，并證實了UBR 5在Hippo-YAP中的關(guān)鍵作用。然后通過AP-MS分析UBR5的互作蛋白，發(fā)現(xiàn)Vgll4是最富集的相互作用蛋白，并證明UBR5通過與同源染色質(zhì)結(jié)合位點上的VGLL4和YAP配位而允許Hippo-YAP信號傳導。進一步研究發(fā)現(xiàn)UBR5通過在K61位點泛素化YAP的拮抗劑VGLL4，進而控制Hippo-YAP信號傳導。
1. 核泛素化允許Hippo-Yap信號傳導
作者使用Ub激活酶抑制劑（TAK-243）評估了整體泛素化對關(guān)鍵核轉(zhuǎn)導信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)TAK-243處理后Hippo-YAP信號傳導受到抑制，抑制細胞質(zhì)泛素化應(yīng)該具有相反的效果，因此作者推斷核泛素化可能是Hippo-YAP信號傳導的決定因素。作者進一步篩選了調(diào)節(jié)Hippo-YAP信號傳導的潛在E3連接酶，并證實了UBR 5在Hippo-YAP中的關(guān)鍵作用。然后通過AP-MS分析UBR5的互作蛋白，發(fā)現(xiàn)Vgll4是最富集的相互作用蛋白，并證明UBR5通過與同源染色質(zhì)結(jié)合位點上的VGLL4和YAP配位而允許Hippo-YAP信號傳導。進一步研究發(fā)現(xiàn)UBR5通過在K61位點泛素化YAP的拮抗劑VGLL4，進而控制Hippo-YAP信號傳導。
圖1 核泛素化允許Hippo-Yap信號傳導
2. UBR5控制肝膽系統(tǒng)發(fā)育
Hippo-YAP信號傳導是肝臟發(fā)育、再生和穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，為了研究Ubr5在肝臟中的功能，作者構(gòu)建了Ubr5肝臟條件性KO小鼠，發(fā)現(xiàn)Ubr5-LKO小鼠在P35時在肝葉上顯示出白色斑塊和可見的壞死區(qū)域，膽小管的寬度在P21時顯著增加，并在P35和P56時繼續(xù)擴張，表明Ubr5缺失引起的膽汁淤積加重。為了研究膽汁淤積是否是肝細胞自主的，作者使用AAV-Ttr-Cre構(gòu)建了肝細胞中特異性Ubr5敲除小鼠（Ubr5 Hep-KO），肝臟冷凍切片的熒光成像顯示Ubr5Hep-KO小鼠肝臟中沒有觀察到明顯的肝壞死，表明肝膽汁淤積不是肝細胞自主的，膽道系統(tǒng)功能障礙應(yīng)該是膽汁淤積誘導肝壞死的原因。此外Ubr5Hep-KO小鼠還出現(xiàn)膽管分支和終末分支長度減少，膽管發(fā)育不良的形狀，進一步研究發(fā)現(xiàn)Ubr5參與了導管損傷條件下的肝細胞重編程。
Hippo-YAP信號傳導是肝臟發(fā)育、再生和穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，為了研究Ubr5在肝臟中的功能，作者構(gòu)建了Ubr5肝臟條件性KO小鼠，發(fā)現(xiàn)Ubr5-LKO小鼠在P35時在肝葉上顯示出白色斑塊和可見的壞死區(qū)域，膽小管的寬度在P21時顯著增加，并在P35和P56時繼續(xù)擴張，表明Ubr5缺失引起的膽汁淤積加重。為了研究膽汁淤積是否是肝細胞自主的，作者使用AAV-Ttr-Cre構(gòu)建了肝細胞中特異性Ubr5敲除小鼠（Ubr5 Hep-KO），肝臟冷凍切片的熒光成像顯示Ubr5Hep-KO小鼠肝臟中沒有觀察到明顯的肝壞死，表明肝膽汁淤積不是肝細胞自主的，膽道系統(tǒng)功能障礙應(yīng)該是膽汁淤積誘導肝壞死的原因。此外Ubr5Hep-KO小鼠還出現(xiàn)膽管分支和終末分支長度減少，膽管發(fā)育不良的形狀，進一步研究發(fā)現(xiàn)Ubr5參與了導管損傷條件下的肝細胞重編程。
圖2 Ubr5控制膽管細胞發(fā)育和肝細胞重編程
3.UBR5-VGLL4-YAP與人類癌癥進展相關(guān)
在調(diào)查臨床蛋白質(zhì)組學腫瘤分析聯(lián)盟（CPTAC）數(shù)據(jù)庫后，作者發(fā)現(xiàn)與鄰近正常組織相比，UBR5在各種腫瘤組織中均勻上調(diào)。肝細胞癌（HCC）的蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)表明UBR5蛋白豐度隨著HCC的進展而增加，在S-Pf（增殖亞組）中表達最高，表明UBR5擴增與HCC侵襲性正相關(guān)。此外，作者還在不同亞組中研究了VGLL4和UBR5之間的相關(guān)性，對于S-Mb（代謝亞組）和S-Me（微環(huán)境失調(diào)亞組），UBR5表達和Hippo-YAP活性相對較低，VGLL4和UBR5不呈負相關(guān)，而以UBR5和YAP活性高為特征的S-Pf中，VGLL4和UBR5呈負相關(guān)，表明腫瘤的進展是由于UBR5和VGLL4之間的平衡被打破，從而增加了YAP的激活，進一步研究發(fā)現(xiàn)靶向UBR5能限制腫瘤類器官的擴張。
在調(diào)查臨床蛋白質(zhì)組學腫瘤分析聯(lián)盟（CPTAC）數(shù)據(jù)庫后，作者發(fā)現(xiàn)與鄰近正常組織相比，UBR5在各種腫瘤組織中均勻上調(diào)。肝細胞癌（HCC）的蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)表明UBR5蛋白豐度隨著HCC的進展而增加，在S-Pf（增殖亞組）中表達最高，表明UBR5擴增與HCC侵襲性正相關(guān)。此外，作者還在不同亞組中研究了VGLL4和UBR5之間的相關(guān)性，對于S-Mb（代謝亞組）和S-Me（微環(huán)境失調(diào)亞組），UBR5表達和Hippo-YAP活性相對較低，VGLL4和UBR5不呈負相關(guān)，而以UBR5和YAP活性高為特征的S-Pf中，VGLL4和UBR5呈負相關(guān)，表明腫瘤的進展是由于UBR5和VGLL4之間的平衡被打破，從而增加了YAP的激活，進一步研究發(fā)現(xiàn)靶向UBR5能限制腫瘤類器官的擴張。
圖3 UBR5-VGLL4-YAP控制人類多種癌癥的進展
實驗結(jié)論
本研究通過靶向YAP拮抗劑VGLL4，發(fā)現(xiàn)UBR5作為Hippo-YAP信號通路的核E3連接酶，并強調(diào)了其在器官發(fā)育和腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵作用，為Hippo-YAP調(diào)控提供了分子框架，并表明核泛素化是YAP依賴性惡性腫瘤的潛在治療靶點。鑒于Hippo-YAP和核泛素化在細胞生物學中的多方面作用，核泛素化-YAP通路的重要性可能會延伸到發(fā)育和腫瘤發(fā)生之外的許多生理和病理過程。
本研究通過靶向YAP拮抗劑VGLL4，發(fā)現(xiàn)UBR5作為Hippo-YAP信號通路的核E3連接酶，并強調(diào)了其在器官發(fā)育和腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵作用，為Hippo-YAP調(diào)控提供了分子框架，并表明核泛素化是YAP依賴性惡性腫瘤的潛在治療靶點。鑒于Hippo-YAP和核泛素化在細胞生物學中的多方面作用，核泛素化-YAP通路的重要性可能會延伸到發(fā)育和腫瘤發(fā)生之外的許多生理和病理過程。
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