基因編輯技術(shù)的原理及其在基因篩查、動物細(xì)胞模型構(gòu)建等中的應(yīng)用
基因編輯（gene editing）是一種基于人工核酸酶的遺傳操作技術(shù)，能對生物體特定目標(biāo)基因進(jìn)行高效修飾。簡單地說，基因編輯包括在活細(xì)胞的基因組中有針對性地插入、刪除或替換 DNA。從上世紀(jì)末人們就開始對基因編輯技術(shù)進(jìn)行探索，在此期間一系列高效核酸酶不斷被發(fā)現(xiàn)，使基因編輯技術(shù)得到了快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。但直到 2013 年 CRISPR/Cas9 技術(shù)成功應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞，才極大地推動了基因編輯技術(shù)的發(fā)展熱潮�；蚓庉嫾夹g(shù)作為一項(xiàng)重要的工具，在基因篩查、動物細(xì)胞模型構(gòu)建等基礎(chǔ)研究中發(fā)揮著重要的作用，也為許多疾病的基因治療提供了新的思路。
同源重組技術(shù)（homologous recombination，HR）是較早使用的基因編輯技術(shù)，其原理是將外源性目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，通過同源序列交換，使外源性 DNA 片段取代原位點(diǎn)上的基因，從而達(dá)到使特定基因失活或修復(fù)缺陷基因的目的。由于 HR 效率極低，且出錯率高，因此其應(yīng)用受到了一定的限制。
20 世紀(jì) 80 年代末、90 年代初，人們發(fā)現(xiàn)通過在特定的基因組靶點(diǎn)誘導(dǎo)雙鏈斷裂（double-stranded break，DSB），能在染色體水平上實(shí)現(xiàn)高效和準(zhǔn)確的基因修飾。DSB 被誘導(dǎo)后，細(xì)胞內(nèi)將啟動兩種主要的修復(fù)機(jī)制：非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）和同源定向修復(fù)（homology directed repair，HDR）。NHEJ 不依賴模板直接連接 DNA 兩端，可以在 DSB 位點(diǎn)有效產(chǎn)生不同長度片段的插入或缺失，通常導(dǎo)致基因功能失活；而在 HDR 中，斷裂鏈依賴于模板進(jìn)行定向修復(fù)，可以實(shí)現(xiàn)特定位點(diǎn)的精確插入、缺失或者堿基置換。
此后，科學(xué)家便專注于開發(fā)各種基于核酸內(nèi)切酶機(jī)制的基因編輯技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)對特定基因組位點(diǎn) DSB的精確誘導(dǎo)。
基因編輯技術(shù)原理
主要基因編輯技術(shù)及原理
目前主流的基因編輯技術(shù)包括鋅指核酸酶（ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）和 CRISPR-Cas 系統(tǒng)，它們的核心原理都是 “精準(zhǔn)切割 DNA + 細(xì)胞自身修復(fù)機(jī)制”。
1. 鋅指核酸酶（ZFN）
- 結(jié)構(gòu)：由 “鋅指蛋白（DNA 識別域）” 和 “FokI 核酸酶（切割域）” 組成。
- 原理：
- 鋅指蛋白通過識別特定的 DNA 堿基序列（每 3 個(gè)堿基對應(yīng)一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)），精準(zhǔn)結(jié)合到目標(biāo)基因位置。
- 兩個(gè) ZFN 分子分別結(jié)合到目標(biāo)序列的兩側(cè)，F(xiàn)okI 核酸酶在二聚化后發(fā)揮活性，切斷雙鏈 DNA。
- 細(xì)胞通過非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HDR）修復(fù)斷裂的 DNA，從而實(shí)現(xiàn)基因的插入、刪除或替換。
- 結(jié)構(gòu)：由 “TALE 蛋白（DNA 識別域）” 和 “FokI 核酸酶（切割域）” 組成。
- 原理：
- TALE 蛋白的識別單元由 34 個(gè)氨基酸組成，其中第 12 和 13 位氨基酸（重復(fù)可變雙殘基，RVD）決定其識別的堿基（如 NI 識別 A，NG 識別 T 等），通過串聯(lián)不同 RVD 的單元，可精準(zhǔn)識別任意 DNA 序列。
- 與 ZFN 類似，兩個(gè) TALEN 分子分別結(jié)合目標(biāo)序列兩側(cè)，F(xiàn)okI 二聚化后切割 DNA，再通過細(xì)胞修復(fù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)基因編輯。
- 核心組成：CRISPR（成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列）和 Cas（CRISPR 相關(guān)蛋白，如 Cas9）。
- 原理：
- 識別階段：人工設(shè)計(jì)的 sgRNA（單引導(dǎo) RNA）通過堿基互補(bǔ)配對，精準(zhǔn)結(jié)合到目標(biāo) DNA 序列，同時(shí)引導(dǎo) Cas9 蛋白定位到該位置。
- 切割階段：Cas9 蛋白具有核酸酶活性，可在 sgRNA 結(jié)合的位置切斷雙鏈 DNA，產(chǎn)生平末端斷裂。
- 修復(fù)階段：
- 非同源末端連接（NHEJ）：細(xì)胞快速修復(fù)斷裂，但容易引入堿基的插入或缺失，導(dǎo)致基因功能失活（常用於敲除基因）。
- 同源重組（HDR）：若提供含目標(biāo)序列的同源模板，細(xì)胞會以模板為參照修復(fù) DNA，實(shí)現(xiàn)基因的精準(zhǔn)插入或替換（常用於基因敲入）。
標(biāo)簽：
基因編輯
同源重組技術(shù)
- 基因編輯技術(shù)TALEN的組成、作用原理及應(yīng)用范圍
- 鋅指核酸酶的組成、作用原理和優(yōu)缺點(diǎn)
- 歸巢核酸內(nèi)切酶的分類、特點(diǎn)及應(yīng)用
- 心腦疾病的潛在靶點(diǎn)P2Y1受體生理功能與相關(guān)疾病的介紹
- 免疫細(xì)胞進(jìn)行回輸?shù)闹苽浼夹g(shù)與操作方法及注意事項(xiàng)
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- 基因編輯技術(shù)的原理及其在基因篩查、動物細(xì)胞模型構(gòu)建等中的應(yīng)用
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