DNA甲基化揭示蘋果干旱脅迫的表觀基因組調(diào)控機制的研究
近日，西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院徐記迪副教授、管清美教授和塔里木大學(xué)王江波副教授團隊合作，通過多組學(xué)分析揭示蘋果在干旱脅迫下的表觀基因組特征。研究綜合運用全基因組重亞硫酸鹽測序（Whole-Genome Bisulfite Sequencing, WGBS）、染色質(zhì)免疫沉淀測序（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing, ChIP-seq）和轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）技術(shù)的多組學(xué)整合分析，揭示了蘋果在干旱處理不同時間點（0天、3天、6天和9天）的DNA甲基化、組蛋白修飾和基因表達變化。研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下蘋果的基因表達、DNA甲基化和組蛋白修飾均發(fā)生顯著變化，并鑒定出兩個關(guān)鍵基因MdABI5和MdOCP3，其通過組蛋白修飾調(diào)控蘋果抗旱性。相關(guān)研究成果以《An integrative multi-omics analysis of histone modifications and DNA methylation reveals the epigenomic landscape in apple under drought stress》為題發(fā)表于《Plant Biotechnology Journal》（IF:10.5）期刊。
標(biāo)題：An integrative multi-omics analysis of histone modifications and DNA methylation reveals the epigenomic landscape in apple under drought stress（組蛋白修飾和DNA甲基化的綜合多組學(xué)分析揭示了干旱脅迫下蘋果的表觀基因組譜）
發(fā)表時間：2025年07月07日
發(fā)表期刊：Plant Biotechnology Journal（PBJ）
影響因子：IF10.5/Q1
技術(shù)平臺：WGBS、ChIP-seq、RNA-seq
作者單位：西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院徐記迪、管清美等
doi: 10.1111/pbi.70173
表觀遺傳調(diào)控在植物發(fā)育和逆境響應(yīng)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。先前研究表明表觀遺傳修飾參與蘋果干旱響應(yīng)，但其干旱響應(yīng)機制仍需要一個全面的表觀基因組學(xué)來表征。本研究在干旱處理后0天、3天、6天和9天時，對蘋果屬植物湖北海棠（Malus hupehensis）進行了轉(zhuǎn)錄組測序、DNA甲基化（WGBS）和六種組蛋白修飾（H3ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K4me3、H3K27me3和H3K36me3）的ChIP-seq分析。研究結(jié)果揭示在干旱處理后6天的差異表達基因變化最為顯著。在干旱處理后3天基因區(qū)域周圍DNA甲基化水平達到最高。在干旱處理下，六種組蛋白修飾的整體富集水平略有下降。上調(diào)的干旱響應(yīng)基因中，具有較高變化倍數(shù)（fold changes）基因與H3K27me3低水平修飾相關(guān)，而具有較低變化倍數(shù)的上調(diào)基因則與H3K4me3高水平修飾相關(guān)。許多干旱響應(yīng)基因（如MYB88、NCED3和JAZ1）受表觀遺傳修飾調(diào)控。研究驗證了MdABI5（受H3K14ac和H3K27me3調(diào)控）和MdOCP3（受H3K9ac和H3K36me3調(diào)控）這兩個受多種表觀遺傳修飾調(diào)控的候選干旱響應(yīng)基因的功能。轉(zhuǎn)基因蘋果在干旱條件下的表型顯示，MdABI5和MdOCP3正向調(diào)控蘋果的抗旱性。本研究結(jié)果為表觀遺傳修飾的分子機制研究提供了新見解，并為提高蘋果的抗旱性提供了理論依據(jù)。
研究方法
（1）植物材料與干旱處理：3月齡蘋果（Malus hupehensis）幼苗，種植于溫室中。干旱處理通過逐步減少土壤水分進行，分別在0天（A0d）、3天（A3d）、6天（A6d）和9天（A9d）取樣。取樣時，選取每株植物的第4-6片葉作為生物學(xué)重復(fù)樣本。
（2）轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）：檢測基因表達水平。
（3）全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）：分析全基因組水平的DNA甲基化狀態(tài)。
（4）染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）：分析H3ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K4me3、H3K27me3和H3K36me3六種組蛋白修飾水平。
（5）轉(zhuǎn)基因植物構(gòu)建與表型分析：將MdABI5和MdOCP3基因?qū)胩O果GL-3品種中，構(gòu)建過表達和RNA干擾轉(zhuǎn)基因株系。通過PCR和RT-qPCR驗證轉(zhuǎn)基因株系，并在干旱條件下評估其表型和生理指標(biāo)。
結(jié)果圖形
（1）不同干旱處理下蘋果的動態(tài)基因表達變化
研究通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，在干旱處理3天（A3d）時，蘋果中有3041個差異表達基因（DEGs），表明許多基因在干旱早期就已經(jīng)響應(yīng)。隨著干旱時間延長，DEGs數(shù)量在6天（A6d）時達到峰值（3818個），9天（A9d）時略有下降（3816個）。基因表達趨勢的聚類分析顯示，大多數(shù)基因在A6d時表達量達到峰值，且與水分剝奪相關(guān)的基因在A6d時顯著富集。研究還發(fā)現(xiàn)一些基因（如TIFY10A-like、XTH33、RPM1-like和PK1）在干旱處理過程中表達量持續(xù)上調(diào)或下調(diào)，這些基因可能在干旱響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。通過對不同表達趨勢的基因組分析，結(jié)果表明其在缺水、激素響應(yīng)、離子穩(wěn)態(tài)和代謝過程等通路中顯著富集，表明A6d是蘋果干旱響應(yīng)的關(guān)鍵階段。
圖1：轉(zhuǎn)錄組差異分析、聚類和功能富集結(jié)果。
(a) 湖北海棠（Malus hupehensis）在干旱處理0天、3天、6天和9天時的表型。
(b) 不同差異比較組合時期中的差異表達基因（DEGs）數(shù)量。
(c) 不同時期DEGs表達趨勢的聚類分析。
(d) 干旱處理下相鄰比較組合中DEGs的重疊情況。
(e) 不同表達趨勢基因組的功能富集比較點圖（第1組：Cluster 1，第2組：Cluster 3，第3組：Cluster 4，第4組：Cluster 5，第5組：Cluster 2、6、7和8）。
（2）蘋果響應(yīng)干旱脅迫的DNA甲基化圖譜
研究通過WGBS技術(shù)分析了蘋果在干旱處理下的DNA甲基化變化。結(jié)果顯示，在干旱處理早期（A3d），基因區(qū)域附近的DNA甲基化水平顯著增加，隨后在A6d略有下降，A9d時又略有回升。表明DNA甲基化在干旱脅迫的早期階段起著關(guān)鍵作用。研究還發(fā)現(xiàn)與對照組相比，干旱處理下蘋果的mCG、mCHG和mCHH三種DNA甲基化類型均顯著增加。此外研究分析了DNA甲基化與基因表達的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)差異甲基化區(qū)域（DMRs）與DEGs在A3d vs A0d、A6d vs A0d和A9d vs A3d的比較組中呈差異變化模式，這與DNA甲基化在啟動子區(qū)域的抑制效應(yīng)一致。研究還分析了DNA甲基化在全基因組水平的分布，發(fā)現(xiàn)mCHH在基因上游2000bp區(qū)域內(nèi)的增加可能與RNA介導(dǎo)的DNA甲基化（RdDM）通路激活有關(guān)，但24nt siRNA的富集并未顯著變化。這表明DNA甲基化水平變化可能受多種因子綜合調(diào)控。
(b) 不同干旱比較組合下與高甲基化和低甲基化DMRs相關(guān)的基因數(shù)量。
(c) 不同比較組合在全基因組水平上每種甲基化類型分布的百分比。
(d) genebody區(qū)域附近24nt siRNA的富集情況。
(e) 在干旱處理下差異表達的DNA甲基化相關(guān)因子的表達模式。
（3）蘋果響應(yīng)干旱脅迫的組蛋白修飾變化圖譜
研究通過ChIP-seq技術(shù)分析了六種組蛋白修飾（H3ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K4me3、H3K27me3和H3K36me3）在干旱處理下的變化。結(jié)果顯示，這些組蛋白修飾在基因區(qū)域和啟動子區(qū)域的分布與基因表達調(diào)控密切相關(guān)。在干旱處理下，組蛋白修飾的整體水平略有下降，但某些基因區(qū)域修飾水平發(fā)生顯著變化。如與對照組相比，A6d時H3K4me3、H3K9ac和H3K14ac水平略有下降，而H3K27me3水平則顯著下降。研究還發(fā)現(xiàn)組蛋白修飾變化與基因表達變化之間存在一定相關(guān)性。如上調(diào)基因與H3K27me3低水平相關(guān)，而上調(diào)基因與H3K4me3高水平相關(guān)。這些結(jié)果表明，組蛋白修飾在蘋果響應(yīng)干旱脅迫過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。
(b) 在干旱處理下差異表達的組蛋白修飾相關(guān)因子的表達模式。
(c) 受組蛋白修飾調(diào)控的干旱響應(yīng)基因的重疊情況。
(d) 干旱處理下組蛋白修飾富集偏好基因的功能分析。
（4）組蛋白修飾和DNA甲基化變化對干旱響應(yīng)中基因表達變化的作用
研究分析了DNA甲基化和組蛋白修飾在干旱響應(yīng)中的協(xié)同作用。結(jié)果顯示，雖然在全基因組水平上DNA甲基化與組蛋白修飾分布并無明顯協(xié)同效應(yīng)，但在某些基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，兩種表觀遺傳修飾可能互作。例如，研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，A6d時有40.9%的DEGs受組蛋白修飾調(diào)控，其中H3K4me3調(diào)控基因數(shù)量最多。研究還發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化和組蛋白修飾在調(diào)控基因表達方面存在一定偏好性。例如上調(diào)基因中，低倍數(shù)變化基因主要受H3K4me3調(diào)控，而高倍數(shù)變化基因則主要受H3K27me3低水平調(diào)控。這些結(jié)果表明，DNA甲基化和組蛋白修飾在蘋果干旱響應(yīng)中通過復(fù)雜機制調(diào)控基因表達。
(b) 受不同表觀遺傳修飾調(diào)控的基因的功能富集表。紅色表示在GO通路中顯著富集，白色表示不顯著。
（5）組蛋白修飾調(diào)控的MdABI5正向調(diào)控蘋果抗旱性
研究發(fā)現(xiàn)，MdABI5基因在干旱脅迫下表達上調(diào)，且其上游的H3K14ac水平增加，H3K27me3水平降低。通過構(gòu)建MdABI5過表達（MdABI5-OE）和RNA干擾（MdABI5-RNAi）轉(zhuǎn)基因植株，研究發(fā)現(xiàn)MdABI5正向調(diào)控蘋果抗旱性。在干旱條件下，MdABI5-OE植株表現(xiàn)出更高的存活率、更低的離子滲漏率和更高的相對含水量，表明其抗旱性增強。而MdABI5-RNAi植株表現(xiàn)出更高的離子滲漏率和更低的存活率，表明其抗旱性減弱。這些結(jié)果表明，MdABI5通過組蛋白修飾調(diào)控蘋果抗旱性。
(b) 干旱處理和對照條件下MdABI5上游H3K14ac和H3K27me3的基因組瀏覽器快照。
(c) ABI5上游組蛋白修飾的ChIP-qPCR驗證。
(d) 在DNA水平上鑒定MdABI5-OE轉(zhuǎn)基因植株。
(e) 在RNA水平上鑒定MdABI5-OE植株。
(f) GL-3（野生型）和MdABI5-OE轉(zhuǎn)基因植株的表型。
(g) 圖（f）中GL-3和三條獨立的MdABI5-OE株系存活率。
(h) GL-3和MdABI5-OE植株在干旱處理下的葉片離子滲漏測定。
(i) GL-3和MdABI5-OE植株在干旱下的葉片相對含水量（RWC）。
(j) GL-3和MdABI5-OE植株的離體葉片在25°C下的水分丟失。
(k) GL-3和MdABI5-OE植株在干旱處理下的光合速率分析。
(l) GL-3和MdABI5-OE植株在干旱處理下的過氧化氫酶（CAT）活性。
(m) GL-3和MdABI5-OE植株在干旱處理下的過氧化氫（H2O2）含量。
(b) 在RNA水平上鑒定MdABI5-RNAi植株。
(c) GL-3和MdABI5-RNAi轉(zhuǎn)基因植株的表型。
(d) 圖（c）中GL-3和兩條獨立的MdABI5-RNAi株系的存活率。
(e) GL-3和MdABI5-RNAi植株在干旱處理下的葉片離子滲漏測定。
(f) GL-3和MdABI5-RNAi植株在干旱下的葉片RWC。
(g) GL-3和MdABI5-RNAi植株的離體葉片在25°C下的水分丟失。
(h) GL-3和MdABI5-RNAi植株在干旱處理下的光合速率分析。
(i) GL-3和MdABI5-RNAi植株在干旱處理下的CAT活性。
(j) GL-3和MdABI5-RNAi植株在干旱處理下的H2O2含量。
（6）組蛋白修飾調(diào)控的MdOCP3正向調(diào)控蘋果抗旱性
研究發(fā)現(xiàn)，MdOCP3基因在干旱脅迫下表達下調(diào)，且其上游的H3K9ac和H3K36me3水平降低。通過構(gòu)建MdOCP3過表達（MdOCP3-OE）和RNA干擾（MdOCP3-RNAi）轉(zhuǎn)基因株系，研究發(fā)現(xiàn)MdOCP3正向調(diào)控蘋果的抗旱性。在干旱條件下，MdOCP3-OE株系表現(xiàn)出更高的存活率、更低的離子滲漏率和更高的相對含水量，表明其抗旱性增強。相反，MdOCP3-RNAi株系則表現(xiàn)出更高的離子滲漏率和更低的存活率，表明其抗旱性減弱。這些結(jié)果表明，MdOCP3通過組蛋白修飾調(diào)控蘋果的抗旱性。
(b) 干旱處理和對照條件下MdOCP3上游H3K9ac和H3K36me3的基因組瀏覽器快照。
(c) OCP3上游組蛋白修飾的ChIP-qPCR驗證。
(d) 在DNA水平上鑒定MdOCP3-OE轉(zhuǎn)基因株系。
(e) 在RNA水平上鑒定MdOCP3-OE株系。
(f) GL-3和MdOCP3-OE轉(zhuǎn)基因植株的表型。
(g) 圖（f）中GL-3和兩條獨立的MdOCP3-OE株系的存活率。
(h) GL-3和MdOCP3-OE植株在干旱處理下的葉片離子滲漏測定。
(i) GL-3和MdOCP3-OE植株在干旱下的葉片相對含水量（RWC）。
(j) GL-3和MdOCP3-OE植株的離體葉片在25°C下的水分丟失。
(k) GL-3和MdOCP3-OE植株在干旱處理下的光合速率分析。
(l-n) 檢測GL-3和MdOCP3-OE植株在干旱處理下的過氧化氫酶（CAT）(l)、過氧化物酶（POD）(m)和丙二醛（MDA）(n)含量。
(o) 采用DAB染色檢測GL-3和MdOCP3-OE中的H2O2含量。
(b) 在RNA水平上鑒定MdOCP3-RNAi株系。
(c) GL-3（野生型）和MdOCP3-RNAi轉(zhuǎn)基因植株的表型。
(d) 圖（c）中GL-3和三條獨立的MdOCP3-RNAi株系存活率。
(e) GL-3和MdOCP3-RNAi植株在干旱處理下的葉片離子滲漏測定。
(f) GL-3和MdOCP3-RNAi植株在干旱下的葉片相對含水量（RWC）。
(g) GL-3和MdOCP3-RNAi植株的離體葉片在25°C下的水分丟失。
(h) GL-3和MdOCP3-RNAi植株在干旱處理下的光合速率分析。
(i-k）檢測GL-3和MdOCP3-RNAi植株在干旱處理下的過氧化氫酶（CAT）(i)、過氧化物酶（POD）(j)和丙二醛（MDA）(k)含量。
(l) 采用DAB染色檢測GL-3和MdOCP3-RNAi中的H2O2含量。
（7）表觀遺傳修飾在干旱調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用
研究分析了表觀遺傳修飾在干旱響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中的作用。通過注釋已知的干旱響應(yīng)基因，研究發(fā)現(xiàn)許多基因受DNA甲基化和組蛋白修飾調(diào)控。例如，在ABA信號通路中，關(guān)鍵基因（如PYLs、PP2C、SnRKs和RAFs）受組蛋白修飾調(diào)控。與鈣離子通路和激酶級聯(lián)反應(yīng)相關(guān)的基因（如CIPKs和CPKs）也受表觀遺傳修飾調(diào)控。這些結(jié)果表明，表觀遺傳修飾在蘋果干旱響應(yīng)的信號和基因表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。
(a) 植物中與干旱脅迫感知和信號傳導(dǎo)相關(guān)的因子的表觀遺傳修飾注釋。TFs數(shù)量指在整個干旱過程中差異表達的所有轉(zhuǎn)錄因子（TFs）。
(b-c) 通過表觀遺傳修飾注釋的ABA依賴和ABA非依賴調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。星形代表受組蛋白乙�；揎椪{(diào)控的DEGs，正方形代表受組蛋白甲基化修飾調(diào)控的DEGs，三角形代表受DNA甲基化修飾調(diào)控的DEGs。不同顏色代表不同類型的修飾。
(b) 在不同土壤含水量干旱處理下，受表觀遺傳修飾調(diào)控的基因和干旱響應(yīng)的表觀遺傳因子的十個差異表達基因的RT-qPCR結(jié)果。
結(jié)論和啟示
本研究通過多組學(xué)分析揭示了蘋果在干旱脅迫下的表觀遺傳調(diào)控機制，特別是DNA甲基化和組蛋白修飾在基因表達調(diào)控中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化和組蛋白修飾在蘋果干旱響應(yīng)中通過復(fù)雜的機制調(diào)控基因表達，且兩個關(guān)鍵基因MdABI5和MdOCP3通過組蛋白修飾正向調(diào)控蘋果的抗旱性。這些發(fā)現(xiàn)為理解植物抗旱的分子機制提供了新的視角，并為通過表觀遺傳修飾改良蘋果抗旱性提供了理論基礎(chǔ)。
WGBS、ChIP-seq和RNA-seq技術(shù)在本研究中發(fā)揮了重要作用，不僅揭示了全基因組水平的表觀遺傳變化，還為解析基因表達調(diào)控機制提供了有力工具。這些技術(shù)的綜合應(yīng)用為未來類似植物抗逆研究提供了方法學(xué)參考。
參考文獻：
Wang S, He J, Hu B, Deng M, Li W, Guo J, Song Y, Zheng Q, Song X, Ma F, Wang J, Guan Q, Xu J. An integrative multi-omics analysis of histone modifications and DNA methylation reveals the epigenomic landscape in apple under drought stress. Plant Biotechnol J. 2025 Jul 7. doi: 10.1111/pbi.70173.
標(biāo)題：An integrative multi-omics analysis of histone modifications and DNA methylation reveals the epigenomic landscape in apple under drought stress（組蛋白修飾和DNA甲基化的綜合多組學(xué)分析揭示了干旱脅迫下蘋果的表觀基因組譜）
發(fā)表期刊：Plant Biotechnology Journal（PBJ）
影響因子：IF10.5/Q1
技術(shù)平臺：WGBS、ChIP-seq、RNA-seq
作者單位：西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院徐記迪、管清美等
doi: 10.1111/pbi.70173
表觀遺傳調(diào)控在植物發(fā)育和逆境響應(yīng)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。先前研究表明表觀遺傳修飾參與蘋果干旱響應(yīng)，但其干旱響應(yīng)機制仍需要一個全面的表觀基因組學(xué)來表征。本研究在干旱處理后0天、3天、6天和9天時，對蘋果屬植物湖北海棠（Malus hupehensis）進行了轉(zhuǎn)錄組測序、DNA甲基化（WGBS）和六種組蛋白修飾（H3ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K4me3、H3K27me3和H3K36me3）的ChIP-seq分析。研究結(jié)果揭示在干旱處理后6天的差異表達基因變化最為顯著。在干旱處理后3天基因區(qū)域周圍DNA甲基化水平達到最高。在干旱處理下，六種組蛋白修飾的整體富集水平略有下降。上調(diào)的干旱響應(yīng)基因中，具有較高變化倍數(shù)（fold changes）基因與H3K27me3低水平修飾相關(guān)，而具有較低變化倍數(shù)的上調(diào)基因則與H3K4me3高水平修飾相關(guān)。許多干旱響應(yīng)基因（如MYB88、NCED3和JAZ1）受表觀遺傳修飾調(diào)控。研究驗證了MdABI5（受H3K14ac和H3K27me3調(diào)控）和MdOCP3（受H3K9ac和H3K36me3調(diào)控）這兩個受多種表觀遺傳修飾調(diào)控的候選干旱響應(yīng)基因的功能。轉(zhuǎn)基因蘋果在干旱條件下的表型顯示，MdABI5和MdOCP3正向調(diào)控蘋果的抗旱性。本研究結(jié)果為表觀遺傳修飾的分子機制研究提供了新見解，并為提高蘋果的抗旱性提供了理論依據(jù)。
研究方法
（1）植物材料與干旱處理：3月齡蘋果（Malus hupehensis）幼苗，種植于溫室中。干旱處理通過逐步減少土壤水分進行，分別在0天（A0d）、3天（A3d）、6天（A6d）和9天（A9d）取樣。取樣時，選取每株植物的第4-6片葉作為生物學(xué)重復(fù)樣本。
（2）轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）：檢測基因表達水平。
（3）全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）：分析全基因組水平的DNA甲基化狀態(tài)。
（4）染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）：分析H3ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K4me3、H3K27me3和H3K36me3六種組蛋白修飾水平。
（5）轉(zhuǎn)基因植物構(gòu)建與表型分析：將MdABI5和MdOCP3基因?qū)胩O果GL-3品種中，構(gòu)建過表達和RNA干擾轉(zhuǎn)基因株系。通過PCR和RT-qPCR驗證轉(zhuǎn)基因株系，并在干旱條件下評估其表型和生理指標(biāo)。
結(jié)果圖形
（1）不同干旱處理下蘋果的動態(tài)基因表達變化
研究通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，在干旱處理3天（A3d）時，蘋果中有3041個差異表達基因（DEGs），表明許多基因在干旱早期就已經(jīng)響應(yīng)。隨著干旱時間延長，DEGs數(shù)量在6天（A6d）時達到峰值（3818個），9天（A9d）時略有下降（3816個）。基因表達趨勢的聚類分析顯示，大多數(shù)基因在A6d時表達量達到峰值，且與水分剝奪相關(guān)的基因在A6d時顯著富集。研究還發(fā)現(xiàn)一些基因（如TIFY10A-like、XTH33、RPM1-like和PK1）在干旱處理過程中表達量持續(xù)上調(diào)或下調(diào)，這些基因可能在干旱響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。通過對不同表達趨勢的基因組分析，結(jié)果表明其在缺水、激素響應(yīng)、離子穩(wěn)態(tài)和代謝過程等通路中顯著富集，表明A6d是蘋果干旱響應(yīng)的關(guān)鍵階段。
圖1：轉(zhuǎn)錄組差異分析、聚類和功能富集結(jié)果。
(b) 不同差異比較組合時期中的差異表達基因（DEGs）數(shù)量。
(c) 不同時期DEGs表達趨勢的聚類分析。
(d) 干旱處理下相鄰比較組合中DEGs的重疊情況。
(e) 不同表達趨勢基因組的功能富集比較點圖（第1組：Cluster 1，第2組：Cluster 3，第3組：Cluster 4，第4組：Cluster 5，第5組：Cluster 2、6、7和8）。
（2）蘋果響應(yīng)干旱脅迫的DNA甲基化圖譜
研究通過WGBS技術(shù)分析了蘋果在干旱處理下的DNA甲基化變化。結(jié)果顯示，在干旱處理早期（A3d），基因區(qū)域附近的DNA甲基化水平顯著增加，隨后在A6d略有下降，A9d時又略有回升。表明DNA甲基化在干旱脅迫的早期階段起著關(guān)鍵作用。研究還發(fā)現(xiàn)與對照組相比，干旱處理下蘋果的mCG、mCHG和mCHH三種DNA甲基化類型均顯著增加。此外研究分析了DNA甲基化與基因表達的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)差異甲基化區(qū)域（DMRs）與DEGs在A3d vs A0d、A6d vs A0d和A9d vs A3d的比較組中呈差異變化模式，這與DNA甲基化在啟動子區(qū)域的抑制效應(yīng)一致。研究還分析了DNA甲基化在全基因組水平的分布，發(fā)現(xiàn)mCHH在基因上游2000bp區(qū)域內(nèi)的增加可能與RNA介導(dǎo)的DNA甲基化（RdDM）通路激活有關(guān)，但24nt siRNA的富集并未顯著變化。這表明DNA甲基化水平變化可能受多種因子綜合調(diào)控。
圖2：WGBS、24nt siRNA分布以及與甲基轉(zhuǎn)移酶變化對干旱響應(yīng)的特征分析。
(a) 全基因組水平上genebody附近區(qū)域的DNA甲基化模式。(b) 不同干旱比較組合下與高甲基化和低甲基化DMRs相關(guān)的基因數(shù)量。
(c) 不同比較組合在全基因組水平上每種甲基化類型分布的百分比。
(d) genebody區(qū)域附近24nt siRNA的富集情況。
(e) 在干旱處理下差異表達的DNA甲基化相關(guān)因子的表達模式。
（3）蘋果響應(yīng)干旱脅迫的組蛋白修飾變化圖譜
研究通過ChIP-seq技術(shù)分析了六種組蛋白修飾（H3ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K4me3、H3K27me3和H3K36me3）在干旱處理下的變化。結(jié)果顯示，這些組蛋白修飾在基因區(qū)域和啟動子區(qū)域的分布與基因表達調(diào)控密切相關(guān)。在干旱處理下，組蛋白修飾的整體水平略有下降，但某些基因區(qū)域修飾水平發(fā)生顯著變化。如與對照組相比，A6d時H3K4me3、H3K9ac和H3K14ac水平略有下降，而H3K27me3水平則顯著下降。研究還發(fā)現(xiàn)組蛋白修飾變化與基因表達變化之間存在一定相關(guān)性。如上調(diào)基因與H3K27me3低水平相關(guān)，而上調(diào)基因與H3K4me3高水平相關(guān)。這些結(jié)果表明，組蛋白修飾在蘋果響應(yīng)干旱脅迫過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。
圖3：組蛋白修飾的特征分析及差異分析。
(a) 各種組蛋白修飾在基因區(qū)域周圍的分布情況。(b) 在干旱處理下差異表達的組蛋白修飾相關(guān)因子的表達模式。
(c) 受組蛋白修飾調(diào)控的干旱響應(yīng)基因的重疊情況。
(d) 干旱處理下組蛋白修飾富集偏好基因的功能分析。
（4）組蛋白修飾和DNA甲基化變化對干旱響應(yīng)中基因表達變化的作用
研究分析了DNA甲基化和組蛋白修飾在干旱響應(yīng)中的協(xié)同作用。結(jié)果顯示，雖然在全基因組水平上DNA甲基化與組蛋白修飾分布并無明顯協(xié)同效應(yīng)，但在某些基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，兩種表觀遺傳修飾可能互作。例如，研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，A6d時有40.9%的DEGs受組蛋白修飾調(diào)控，其中H3K4me3調(diào)控基因數(shù)量最多。研究還發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化和組蛋白修飾在調(diào)控基因表達方面存在一定偏好性。例如上調(diào)基因中，低倍數(shù)變化基因主要受H3K4me3調(diào)控，而高倍數(shù)變化基因則主要受H3K27me3低水平調(diào)控。這些結(jié)果表明，DNA甲基化和組蛋白修飾在蘋果干旱響應(yīng)中通過復(fù)雜機制調(diào)控基因表達。
圖4：六種組蛋白修飾、DNA甲基化及其在干旱處理下的調(diào)控功能之間相關(guān)性。
(a) 由DNA甲基化和組蛋白修飾共同調(diào)控的差異表達基因以及這些調(diào)控基因表達變化的Upset圖。所有受表觀遺傳修飾調(diào)控的上調(diào)和下調(diào)DEGs與表觀遺傳修飾、log2（變化倍數(shù)）和組蛋白修飾之間的關(guān)系熱圖。紅色表示與表觀遺傳修飾呈正相關(guān)，而藍色表示負相關(guān)。(b) 受不同表觀遺傳修飾調(diào)控的基因的功能富集表。紅色表示在GO通路中顯著富集，白色表示不顯著。
（5）組蛋白修飾調(diào)控的MdABI5正向調(diào)控蘋果抗旱性
研究發(fā)現(xiàn)，MdABI5基因在干旱脅迫下表達上調(diào)，且其上游的H3K14ac水平增加，H3K27me3水平降低。通過構(gòu)建MdABI5過表達（MdABI5-OE）和RNA干擾（MdABI5-RNAi）轉(zhuǎn)基因植株，研究發(fā)現(xiàn)MdABI5正向調(diào)控蘋果抗旱性。在干旱條件下，MdABI5-OE植株表現(xiàn)出更高的存活率、更低的離子滲漏率和更高的相對含水量，表明其抗旱性增強。而MdABI5-RNAi植株表現(xiàn)出更高的離子滲漏率和更低的存活率，表明其抗旱性減弱。這些結(jié)果表明，MdABI5通過組蛋白修飾調(diào)控蘋果抗旱性。
圖5：MdABI5過表達（MdABI5-OE）增強蘋果抗旱性。
(a) 湖北海棠（Malus hupehensis）在不同土壤含水量下干旱處理時MdABI5的表達情況。(b) 干旱處理和對照條件下MdABI5上游H3K14ac和H3K27me3的基因組瀏覽器快照。
(c) ABI5上游組蛋白修飾的ChIP-qPCR驗證。
(d) 在DNA水平上鑒定MdABI5-OE轉(zhuǎn)基因植株。
(e) 在RNA水平上鑒定MdABI5-OE植株。
(f) GL-3（野生型）和MdABI5-OE轉(zhuǎn)基因植株的表型。
(g) 圖（f）中GL-3和三條獨立的MdABI5-OE株系存活率。
(h) GL-3和MdABI5-OE植株在干旱處理下的葉片離子滲漏測定。
(i) GL-3和MdABI5-OE植株在干旱下的葉片相對含水量（RWC）。
(j) GL-3和MdABI5-OE植株的離體葉片在25°C下的水分丟失。
(k) GL-3和MdABI5-OE植株在干旱處理下的光合速率分析。
(l) GL-3和MdABI5-OE植株在干旱處理下的過氧化氫酶（CAT）活性。
(m) GL-3和MdABI5-OE植株在干旱處理下的過氧化氫（H2O2）含量。
圖6：MdABI5的RNA干擾（MdABI5-RNAi）降低蘋果抗旱性。
(a) 在DNA水平上鑒定MdABI5-RNAi轉(zhuǎn)基因植株。(b) 在RNA水平上鑒定MdABI5-RNAi植株。
(c) GL-3和MdABI5-RNAi轉(zhuǎn)基因植株的表型。
(d) 圖（c）中GL-3和兩條獨立的MdABI5-RNAi株系的存活率。
(e) GL-3和MdABI5-RNAi植株在干旱處理下的葉片離子滲漏測定。
(f) GL-3和MdABI5-RNAi植株在干旱下的葉片RWC。
(g) GL-3和MdABI5-RNAi植株的離體葉片在25°C下的水分丟失。
(h) GL-3和MdABI5-RNAi植株在干旱處理下的光合速率分析。
(i) GL-3和MdABI5-RNAi植株在干旱處理下的CAT活性。
(j) GL-3和MdABI5-RNAi植株在干旱處理下的H2O2含量。
（6）組蛋白修飾調(diào)控的MdOCP3正向調(diào)控蘋果抗旱性
研究發(fā)現(xiàn)，MdOCP3基因在干旱脅迫下表達下調(diào)，且其上游的H3K9ac和H3K36me3水平降低。通過構(gòu)建MdOCP3過表達（MdOCP3-OE）和RNA干擾（MdOCP3-RNAi）轉(zhuǎn)基因株系，研究發(fā)現(xiàn)MdOCP3正向調(diào)控蘋果的抗旱性。在干旱條件下，MdOCP3-OE株系表現(xiàn)出更高的存活率、更低的離子滲漏率和更高的相對含水量，表明其抗旱性增強。相反，MdOCP3-RNAi株系則表現(xiàn)出更高的離子滲漏率和更低的存活率，表明其抗旱性減弱。這些結(jié)果表明，MdOCP3通過組蛋白修飾調(diào)控蘋果的抗旱性。
圖7：MdOCP3過表達（MdOCP3-OE）增強蘋果抗旱性。
(a) 湖北海棠（Malus hupehensis）在不同土壤含水量下干旱處理時MdOCP3的表達情況。(b) 干旱處理和對照條件下MdOCP3上游H3K9ac和H3K36me3的基因組瀏覽器快照。
(c) OCP3上游組蛋白修飾的ChIP-qPCR驗證。
(d) 在DNA水平上鑒定MdOCP3-OE轉(zhuǎn)基因株系。
(e) 在RNA水平上鑒定MdOCP3-OE株系。
(f) GL-3和MdOCP3-OE轉(zhuǎn)基因植株的表型。
(g) 圖（f）中GL-3和兩條獨立的MdOCP3-OE株系的存活率。
(h) GL-3和MdOCP3-OE植株在干旱處理下的葉片離子滲漏測定。
(i) GL-3和MdOCP3-OE植株在干旱下的葉片相對含水量（RWC）。
(j) GL-3和MdOCP3-OE植株的離體葉片在25°C下的水分丟失。
(k) GL-3和MdOCP3-OE植株在干旱處理下的光合速率分析。
(l-n) 檢測GL-3和MdOCP3-OE植株在干旱處理下的過氧化氫酶（CAT）(l)、過氧化物酶（POD）(m)和丙二醛（MDA）(n)含量。
(o) 采用DAB染色檢測GL-3和MdOCP3-OE中的H2O2含量。
圖8：MdOCP3的RNA干擾（（MdOCP3-RNAi））降低了蘋果的抗旱性。
(a) 在DNA水平上鑒定MdOCP3-RNAi轉(zhuǎn)基因株系。(b) 在RNA水平上鑒定MdOCP3-RNAi株系。
(c) GL-3（野生型）和MdOCP3-RNAi轉(zhuǎn)基因植株的表型。
(d) 圖（c）中GL-3和三條獨立的MdOCP3-RNAi株系存活率。
(e) GL-3和MdOCP3-RNAi植株在干旱處理下的葉片離子滲漏測定。
(f) GL-3和MdOCP3-RNAi植株在干旱下的葉片相對含水量（RWC）。
(g) GL-3和MdOCP3-RNAi植株的離體葉片在25°C下的水分丟失。
(h) GL-3和MdOCP3-RNAi植株在干旱處理下的光合速率分析。
(i-k）檢測GL-3和MdOCP3-RNAi植株在干旱處理下的過氧化氫酶（CAT）(i)、過氧化物酶（POD）(j)和丙二醛（MDA）(k)含量。
(l) 采用DAB染色檢測GL-3和MdOCP3-RNAi中的H2O2含量。
（7）表觀遺傳修飾在干旱調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用
研究分析了表觀遺傳修飾在干旱響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中的作用。通過注釋已知的干旱響應(yīng)基因，研究發(fā)現(xiàn)許多基因受DNA甲基化和組蛋白修飾調(diào)控。例如，在ABA信號通路中，關(guān)鍵基因（如PYLs、PP2C、SnRKs和RAFs）受組蛋白修飾調(diào)控。與鈣離子通路和激酶級聯(lián)反應(yīng)相關(guān)的基因（如CIPKs和CPKs）也受表觀遺傳修飾調(diào)控。這些結(jié)果表明，表觀遺傳修飾在蘋果干旱響應(yīng)的信號和基因表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。
圖9：植物對干旱脅迫的感知、信號傳導(dǎo)以及ABA依賴和非依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
(a) 植物中與干旱脅迫感知和信號傳導(dǎo)相關(guān)的因子的表觀遺傳修飾注釋。TFs數(shù)量指在整個干旱過程中差異表達的所有轉(zhuǎn)錄因子（TFs）。
(b-c) 通過表觀遺傳修飾注釋的ABA依賴和ABA非依賴調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。星形代表受組蛋白乙�；揎椪{(diào)控的DEGs，正方形代表受組蛋白甲基化修飾調(diào)控的DEGs，三角形代表受DNA甲基化修飾調(diào)控的DEGs。不同顏色代表不同類型的修飾。
圖10：表觀遺傳因子及表觀遺傳調(diào)控基因的基因組快照和表達驗證。
(a) 基因組瀏覽器快照顯示6天干旱處理和對照中轉(zhuǎn)錄本水平與DNA甲基化和組蛋白修飾之間的關(guān)系。(b) 在不同土壤含水量干旱處理下，受表觀遺傳修飾調(diào)控的基因和干旱響應(yīng)的表觀遺傳因子的十個差異表達基因的RT-qPCR結(jié)果。
結(jié)論和啟示
本研究通過多組學(xué)分析揭示了蘋果在干旱脅迫下的表觀遺傳調(diào)控機制，特別是DNA甲基化和組蛋白修飾在基因表達調(diào)控中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化和組蛋白修飾在蘋果干旱響應(yīng)中通過復(fù)雜的機制調(diào)控基因表達，且兩個關(guān)鍵基因MdABI5和MdOCP3通過組蛋白修飾正向調(diào)控蘋果的抗旱性。這些發(fā)現(xiàn)為理解植物抗旱的分子機制提供了新的視角，并為通過表觀遺傳修飾改良蘋果抗旱性提供了理論基礎(chǔ)。
WGBS、ChIP-seq和RNA-seq技術(shù)在本研究中發(fā)揮了重要作用，不僅揭示了全基因組水平的表觀遺傳變化，還為解析基因表達調(diào)控機制提供了有力工具。這些技術(shù)的綜合應(yīng)用為未來類似植物抗逆研究提供了方法學(xué)參考。
參考文獻：
Wang S, He J, Hu B, Deng M, Li W, Guo J, Song Y, Zheng Q, Song X, Ma F, Wang J, Guan Q, Xu J. An integrative multi-omics analysis of histone modifications and DNA methylation reveals the epigenomic landscape in apple under drought stress. Plant Biotechnol J. 2025 Jul 7. doi: 10.1111/pbi.70173.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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