PCR擴(kuò)增實驗中克隆引物設(shè)計的原則和步驟

PCR擴(kuò)增目的基因，膠圖總是一片空白？反復(fù)摸索退火溫度，膠圖全是雜帶？同學(xué)，你需要換一對引物了，一份包教包會的克隆引物設(shè)計指南送給你。

引物設(shè)計的一般原則
設(shè)計引物需要遵循的原則較多，如引物要有特異性，GC含量在40%-60%之間，Tm值在55-65℃，一對引物Tm值與GC含量不能相差太多，長度在16~30 bp為宜，避免一對引物發(fā)生互補(bǔ)，3′端不能選擇A，堿基要隨機(jī)分布等。

基因克隆引物通常由酶切識別序列和與靶基因互補(bǔ)配對的特異性序列兩部分組成，特異性序列的靶點在基因CDS序列的兩端，是相對固定的。因此克隆引物中的可變序列較少，需在盡量不改變特異性序列的條件下，通過修改酶切識別序列優(yōu)化引物對。

兩步學(xué)會設(shè)計克隆引物
1.明確載體多克隆位點處限制酶的種類，并下載目的基因CDS序列。
基因克隆中使用引物一是為了將基因CDS序列從cDNA中大量擴(kuò)增，便于后續(xù)膠回收利用，二是通過酶切將基因連入載體中用于后續(xù)實驗。因此需在CDS序列中篩選多克隆位點處所有限制酶的識別序列，選擇載體多克隆位點的限制酶時，應(yīng)避開在CDS內(nèi)部存在識別序列的限制酶，否則會導(dǎo)致CDS序列被酶切，進(jìn)而連入載體的序列不完整。

若CDS序列內(nèi)含有多克隆位點處所有限制酶識別序列，則考慮更換載體，若無法更換載體則可通過優(yōu)化不完全酶切時間，獲得酶切的CDS全長序列，或采用無縫克隆試劑盒，跳過酶切步驟。

2. 通過修改酶切識別序列優(yōu)化引物對。
將所有可用的酶切識別序列分別連接至引物對5’端，可獲得多對引物，利用生信軟件分析不同引物對的GC含量，TM值，序列特異性等信息，獲得評分較高的引物對用于后續(xù)實驗。

若評分較高的引物對還是存在GC含量、TM值相差過大，特異性不好等問題，可以通過在酶切識別序列兩端添加1-3bp保護(hù)序列，逐步調(diào)整和優(yōu)化引物對。