芍藥苷通過(guò)養(yǎng)陰清肺湯減輕小鼠矽肺MMP-12炎癥

文獻(xiàn)信息
華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院、華北理工大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院、國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)塵肺病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等單位的研究成果《Paeoniflorin mitigates MMP-12 inflammation in silicosis via Yang-Yin-Qing-Fei Decoction in murine models》（芍藥苷通過(guò)養(yǎng)陰清肺湯減輕小鼠矽肺MMP-12炎癥）在雜志《Phytomedicine》（IF：6.7）上發(fā)表。平生公司的離活一體CT（NEMO）在論文中提供了小鼠肺部圖像和定量分析。
該研究的通訊作者為徐丁潔；第一作者是李田。

文獻(xiàn)摘要
背景:矽肺帶來(lái)了重大的臨床挑戰(zhàn)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，中醫(yī)(TCM)正在成為潛在的治療途徑。然而，中醫(yī)治療矽肺的確切效果和機(jī)制仍不確定，并存在爭(zhēng)議。
目的:研究養(yǎng)陰清肺湯及其關(guān)鍵成分芍藥苷對(duì)矽肺的治療作用及其機(jī)制。
方法:用YYQFD、吡非尼酮(PFD)或芍藥苷治療硅小鼠。用二氧化硅、基質(zhì)金屬蛋白酶-12 (MMP-12)或TGF-β1刺激RAW264.7細(xì)胞和小鼠肺成纖維細(xì)胞(MLF)，然后用芍藥苷、PFD或相關(guān)抑制劑處理。采用高效液相色譜(HPLC)對(duì)YYQFD的成分進(jìn)行了表征。通過(guò)組織病理學(xué)檢查、顯微ct成像、肺功能和Western blot分析評(píng)估肺纖維化嚴(yán)重程度。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析，研究了YYQFD在矽肺中調(diào)控的基因表達(dá)譜和靶基因。

 結(jié)果:YYQFD治療可改善二氧化硅導(dǎo)致的肺纖維化。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定MMP-12是YYQFD和PFD的潛在共同靶點(diǎn)。此外，研究還揭示了MMP-12在二氧化硅誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中的潛在促炎作用。芍藥苷是YYQFD中最具特色的化合物之一，它通過(guò)直接結(jié)合作用減弱了二氧化硅誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中MMP-12的增加及其衍生的炎癥因子。值得注意的是，芍藥苷通過(guò)抑制二氧化硅暴露小鼠的MMP-12衍生炎癥因子和TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化發(fā)揮抗纖維化作用。
結(jié)論:本研究強(qiáng)調(diào)芍藥苷是YYQFD中最主要的生物活性化合物之一，強(qiáng)調(diào)其在體內(nèi)和體外均具有減輕巨噬細(xì)胞來(lái)源的MMP-12驅(qū)動(dòng)的肺部炎癥和減少肺纖維化的能力。

實(shí)驗(yàn)方法
YYQFD制備
YYQFD按照2015年版《中國(guó)藥典》指導(dǎo)原則配制而成。加入體積為8倍(v/w)的超純水浸泡30分鐘，煮沸2小時(shí)提取湯劑。隨后，將淡水加入到草藥混合物中，并將其再煮沸一小時(shí)以獲得第二次湯劑。兩種煎劑混合，通過(guò)八層紗布過(guò)濾。濾液用超純水稀釋至終體積為500 ml，對(duì)應(yīng)原藥濃度為0.086 g/ml。在之前的臨床研究中使用的劑量為2.19 g/kg，隨后的實(shí)驗(yàn)將其轉(zhuǎn)換為約20 g/kg。采用超高效液相色譜-高分辨率質(zhì)譜法(UHPLC-HRMS)對(duì)YYQFD的主要成分進(jìn)行鑒定。

 小鼠模型建立
8周齡雄性C57BL/6 J小鼠在華北理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的特定無(wú)病原體(SPF)環(huán)境中飼養(yǎng)。如前所述，通過(guò)支氣管輸注10mg二氧化硅懸浮液構(gòu)建矽肺小鼠模型。70只小鼠隨機(jī)分為5組(每組10只):(1)對(duì)照組:0.9%生理鹽水;(2)矽肺病組:二氧化硅暴露;(3) YYQFD低劑量治療組:暴露二氧化硅14天后，灌胃20 g/kg YYQFD 14天;(4) YYQFD高劑量處理組:二氧化硅暴露加40g /kg YYQFD;(5)陽(yáng)性對(duì)照組(PFD) :二氧化硅暴露加200 mg/100 μl PFD 灌胃。(6)芍藥苷低劑量組:二氧化硅暴露加芍藥苷50 mg/kg;(7)芍藥苷高劑量組:二氧化硅暴露加100 mg/kg芍藥苷。
 Micro CT分析

使用NEMO（NMC-200）微型CT儀(平生醫(yī)療科技有限公司)獲得活體小鼠肺部的CT圖像。將小鼠置于俯臥位，使用Cruiser軟件采集數(shù)據(jù)，使用Recon軟件離線重建數(shù)據(jù)，使用Avatar分析數(shù)據(jù)并重建肺部結(jié)構(gòu)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
如圖1A所示，YYQFD低劑量、YYQFD高劑量和PFD治療組的矽肺病變和膠原沉積顯著減少。Micro-CT分析進(jìn)一步顯示，與矽肺組相比，YYQFD和PFD治療組的高密度體積百分比下降(圖1B)。此外，對(duì)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物Desmin的免疫熒光檢測(cè)顯示，在YYQFD(低劑量和高劑量)組中，Desmin的陽(yáng)性表達(dá)顯著降低(圖2A)。此外，纖維化標(biāo)志物，包括Col I、Fn1、α-SMA和PAI-1，在YYQFD(低劑量和高劑量)以及PFD治療組中均表現(xiàn)出下調(diào)(圖2B)。

圖1  YYQFD減輕硅小鼠膠原沉積。(B) CT成像:冠狀面、橫切面、垂直平面成像使我們能夠看到肺部的結(jié)構(gòu)變化。三維重建提供了肺部結(jié)構(gòu)的全面視圖。數(shù)據(jù)以mean±SD表示，每組n = 3。C:控制;S:矽肺病;Y-l: YYQF-LOW;Y-H: YYQF-HIGH;PFD: Pirfenidone。

此外，在巨噬細(xì)胞耗竭模型中，觀察到MMP-12和其他纖維化標(biāo)志物的下調(diào)，以及肺纖維化的減少(圖5A和B)。TLR4抑制劑(TLR4- c34)治療降低了二氧化硅誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中的MMP-12水平(圖5C)。此外，MMP-12抑制劑還能減弱二氧化硅誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中炎癥標(biāo)志物(如TNF-α、IL-6、IL-1β和IL- 17A)的升高(圖5D)。結(jié)果提示MMP-12可能通過(guò)二氧化硅誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)通路調(diào)控促炎作用。

圖5 巨噬細(xì)胞來(lái)源的MMP-12在肺中的作用。(A)各組肺組織顯微CT圖像及相應(yīng)的H.E.圖像。

為了研究芍藥苷的抗纖維化作用，采用矽肺小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如圖9所示，芍藥苷治療導(dǎo)致矽肺病變、膠原沉積和肺功能受損的減少。芍藥苷處理也導(dǎo)致矽結(jié)節(jié)內(nèi)肌成纖維細(xì)胞減少(圖10A)，纖維化標(biāo)志物包括Col I、Fn1、α-SMA和PAI-1水平降低(圖10B)。

圖9 芍藥苷減輕矽肺小鼠小鼠膠原沉積。(B)小鼠CT成像的冠狀面、橫切面、垂直面及三維擬合圖像。數(shù)據(jù)以mean±SD表示，每組n = 3。C:控制;S:矽肺病;PF-l:矽肺+ Paeoniflorin-Low;PF-H:矽肺+ Paeoniflorin-High。

文獻(xiàn)結(jié)論
總的來(lái)說(shuō)，本研究揭示了YYQFD的藥理作用、潛在途徑和活性成分。作者的研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了YYQFD及其成分芍藥苷在減輕二氧化硅暴露小鼠肺纖維化方面的治療前景。

 此外，作者已經(jīng)揭示了二氧化硅誘導(dǎo)的MMP- 12的產(chǎn)生可以作為肺部炎癥的驅(qū)動(dòng)因?qū)е路卫w維化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。重要的是，作者的研究結(jié)果表明YYQFD和芍藥苷可以逆轉(zhuǎn)矽肺病中MMP-12引起的炎癥，為進(jìn)一步探索提供了潛在的治療途徑。

使用設(shè)備

                                  Micro CT (型號(hào)：NEMO) (平生醫(yī)療科技)

                                          影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）