氧化鎂納米顆粒調(diào)節(jié)相分離形成骨小梁結(jié)構(gòu)的冷凍凝膠，用于骨缺損修復(fù)

文獻(xiàn)信息
寧波大學(xué)附屬李惠利醫(yī)院等單位的研究成果“Magnesium oxide nanoparticles modulate phase separation to form trabecular-structured cryogels for bone defect repair”（氧化鎂納米顆粒調(diào)節(jié)相分離形成骨小梁結(jié)構(gòu)的冷凍凝膠用于骨缺損修復(fù)）在《Materials Today Bio》雜志上發(fā)表。平生公司的離體CT（VENUS）在論文中提供股骨標(biāo)本圖像和定量分析。該研究的通訊作者為彭兆祥主任。第一作者為柳伯韜。

文獻(xiàn)摘要
嚴(yán)重的骨缺損帶來(lái)了顯著的治療挑戰(zhàn)，通常需要大量的骨移植才能進(jìn)行有效的干預(yù)，從而導(dǎo)致巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。自體骨的稀缺和小梁骨的復(fù)雜結(jié)構(gòu)需要開(kāi)發(fā)具有成本效益的仿生移植物材料。在這項(xiàng)研究中，作者使用冷凍誘導(dǎo)相分離方法開(kāi)發(fā)了一種摻入MgO納米粒子的水凝膠支架（P-G-C-MgO2）支架實(shí)現(xiàn)了多孔結(jié)構(gòu)，孔隙率為56.48±7.062%，平均孔徑為565.7±53.62μm，與天然小梁骨非常相似。它在降解過(guò)程中表現(xiàn)出卓越的機(jī)械穩(wěn)定性，并持續(xù)釋放生物活性成分，包括Mg2+、I型膠原蛋白和明膠。這些特征促進(jìn)了早期細(xì)胞募集和成骨分化。在股骨遠(yuǎn)端骨缺損模型中，P-G-C-MgO2表現(xiàn)出優(yōu)異的骨整合，并顯著增強(qiáng)了新骨再生。

實(shí)驗(yàn)方法
空隙結(jié)構(gòu)分析
體外礦化后，使用micro-CT系統(tǒng)（VENUS平生醫(yī)療科技有限公司）掃描水凝膠支架。在90kV的管電壓和0.08mA的管電流下進(jìn)行掃描，采用連續(xù)掃描采集模式收集數(shù)據(jù)。然后使用Avatar軟件（Avatar 平生醫(yī)療科技有限公司）中的FDK算法重建掃描數(shù)據(jù)，得到水凝膠支架的三維重建圖像。選擇整個(gè)水凝膠支架作為感興趣區(qū)域（ROI）進(jìn)行進(jìn)一步分析。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化閾值（>-350）來(lái)定義水凝膠支架，剩余區(qū)域被歸類為支架之間的孔隙空間。在選定的區(qū)域內(nèi)，對(duì)孔隙孔隙度、孔徑、比表面積和連通性進(jìn)行了分析和量化。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
使用體重約250克的8周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠建立股骨髁缺損修復(fù)模型。根據(jù)之前報(bào)道的方案，成功麻醉后用聚維酮碘對(duì)后肢進(jìn)行消毒。沿內(nèi)側(cè)皮膚和皮下組織做縱向切口，然后鈍性解剖股內(nèi)側(cè)肌，通過(guò)股四頭肌內(nèi)側(cè)入路暴露股骨髁。在股骨內(nèi)側(cè)髁的頂點(diǎn)，使用克氏針鉆一個(gè)導(dǎo)向孔，鉆頭平行于股骨遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)面，以形成直徑2.5mm的經(jīng)皮質(zhì)缺損。在確認(rèn)缺損通道對(duì)齊令人滿意后，使用生理記錄儀徹底沖洗掉骨碎片。

Micro-CT掃描
按照上述方案，使用micro-CT系統(tǒng)（VENUS平生醫(yī)療科技有限公司）掃描在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)采集的股骨標(biāo)本。使用Avatar軟件中的FDK算法重建采集的數(shù)據(jù)集，以生成股骨標(biāo)本的詳細(xì)三維（3D）表示。在重建的3D圖像中，沿著水凝膠植入軸描繪了直徑為2.5mm的ROI，并應(yīng)用了標(biāo)準(zhǔn)化閾值（>750）來(lái)識(shí)別骨組織。在預(yù)定義的ROI內(nèi)計(jì)算和分析骨相關(guān)參數(shù)，包括新形成的骨體積（BV）、骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、小梁數(shù)量（Tb.N）、小梁厚度（Tb.Th）和小梁間距（Tb.Sp）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
多孔結(jié)構(gòu)在骨缺損修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用，研究表明，孔徑接近生理骨的高度連接的多尺度結(jié)構(gòu)，以及高孔隙率，可以顯著促進(jìn)內(nèi)源性骨生長(zhǎng)和代謝物的有效交換。顯微CT三維掃描圖像清晰地顯示了不同水凝膠樣品的整體形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征。P-G-C水凝膠結(jié)構(gòu)相對(duì)致密，內(nèi)部孔隙較��；然而，隨著MgO含量從P-GC-MgO0.1增加到P-GC-MgO1，水凝膠結(jié)構(gòu)變得更加多孔，顯示出逐漸增加的多尺度多孔結(jié)構(gòu)和更大的孔徑。隨著MgO納米粒子含量的持續(xù)增加，孔徑減小，孔結(jié)構(gòu)開(kāi)始閉合。P-G-C-MgO2顯示了最合適的具有開(kāi)放通道的微/納米多尺度多孔結(jié)構(gòu)（圖2a）結(jié)構(gòu)分析證實(shí)了這些結(jié)論。含有MgO納米顆粒的水凝膠樣品表現(xiàn)出更高的孔隙率，例如P-G-CMgO2的孔隙率為56.48±7.062%，接近生理骨組織的孔隙率。然而，當(dāng)MgO含量增加到3%（P-G-C-MgO3）時(shí)，孔隙率降至33.34±11.56%，表明過(guò)量的MgO納米粒子可能會(huì)干擾相分離（圖2b）。關(guān)于孔徑，隨著MgO含量的增加，水凝膠孔徑逐漸減小，從P-G-C-MgO0.1中的1265±113.0μm減小到P-G-CMgO2中的565.7±53.62μm。P-GC-MgO3的孔徑（597.1±27.19μm）與P-GC-MgO2的孔徑相似，沒(méi)有顯著變化（圖2c）。此外，P-G-C-MgO2由于其孔結(jié)構(gòu)接近生理骨的孔結(jié)構(gòu)，顯示出最高的表面積，并且與相互連接的多孔結(jié)構(gòu)具有更高的連接率（圖2b-e）。這些結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)有助于內(nèi)源性骨生長(zhǎng)、血管向內(nèi)生長(zhǎng)以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝物的有效運(yùn)輸。

圖2 水凝膠支架的孔結(jié)構(gòu)分析。（a） P-G-C、P-G-C-MgO0.1、P-GC-MgO0.5、P-GC-MgO 1、P-GC-MnO2和P-GC-MgO 3的顯微CT圖像。（b–e）每組水凝膠支架的孔隙率、孔徑、內(nèi)表面積和連接性。

作者在SD大鼠中建立了股骨遠(yuǎn)端缺損模型，并在每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中植入水凝膠，以評(píng)估其修復(fù)骨缺損的療效。使用顯微CT掃描對(duì)術(shù)后4周和8周采集的股骨標(biāo)本進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。如圖7a所示，在整個(gè)觀察期間，每個(gè)水凝膠支架組都保持了一致的固定效果。

到4周時(shí)，在缺陷區(qū)域內(nèi)只檢測(cè)到輕微的骨沉積，沒(méi)有明顯的內(nèi)源性骨向內(nèi)生長(zhǎng)到支架中。作者假設(shè)，這種有限的早期骨形成可能是由于支架降解所需的滯后性，以完全暴露多孔結(jié)構(gòu)以及骨再生的自然生理時(shí)間線。然而，到8周的時(shí)間點(diǎn)，所有組都表現(xiàn)出明顯的內(nèi)源性骨生長(zhǎng)，PG-C-MgO2組在CT成像上顯示出最明顯的骨沉積。這表明，一旦水凝膠降解，多孔支架結(jié)構(gòu)為骨向內(nèi)生長(zhǎng)提供了合適的框架，而降解的生物活性副產(chǎn)物可能有助于早期細(xì)胞募集并增強(qiáng)新骨的形成。BV的定量分析顯示，四周時(shí)各組之間沒(méi)有顯著差異。然而，在8周時(shí)，P-GC-MgO2組的BV明顯高于P組（圖7b）。此外，P-G-C-MgO2組在8周時(shí)的BV比率在所有組中最高，表明支架降解后暴露的多孔結(jié)構(gòu)為骨組織生長(zhǎng)提供了充足的空間（圖7c）。此外，P-GC-MgO2組每單位體積的鈣沉積密度高于其他組。到8周時(shí)，各組在小梁分離或數(shù)量方面沒(méi)有顯著差異，這表明P-G-C-MgO2組BV比率的增加可能主要是由于小梁厚度的增加（圖7d-G）。這些發(fā)現(xiàn)表明，P-GC-MgO2水凝膠在體內(nèi)植入模型中表現(xiàn)出優(yōu)異的固定和骨缺損修復(fù)能力。

圖7 使用Micro-CT對(duì)SD大鼠股骨頭缺損中P-G-C-MgO2的新骨形成進(jìn)行體內(nèi)分析。（a）股骨的Micro-CT圖像和定義的感興趣區(qū)域（ROI）內(nèi)的重建骨組織圖像（藍(lán)色表示再生骨；綠色表示有缺陷的骨區(qū)域）。（b–g）植入后4周和8周ROI內(nèi)新骨形成的定量分析。（b）BV，（c）BV/TV，（d）BMD，（e）Tb.Sp、（f）Tb.Th和（g）Tb.N。

與純PVA水凝膠相比，生物活性成分（明膠、I型膠原和MgO納米粒子）的整合顯著增強(qiáng)了rBMSC的體外募集和成骨誘導(dǎo)活性。在體內(nèi)研究中，這種支架充當(dāng)了細(xì)胞募集的利基，顯示出顯著的骨缺損修復(fù)能力，其具有成本效益的制備、仿生小梁結(jié)構(gòu)、優(yōu)異的機(jī)械性能和良好的機(jī)械性能。

使用設(shè)備

 Micro CT（型號(hào)：VENUS）（平生醫(yī)療科技）
影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）