鉻系星形聚合物：具有水溶性和隱身性能的短波紅外發(fā)射熒光團(tuán)

本文要點：短波紅外（SWIR）區(qū)域的熒光成像已成為研究哺乳動物的重要工具。目前，聚甲炔染料在體內(nèi)成像應(yīng)用中的進(jìn)展主要受限于疏水性和/或非特異性蛋白結(jié)合。本文采用獨特方法結(jié)合親水性與隱匿行為，通過精確設(shè)計的聚(2-甲基-2-噁唑啉)（POx）星形聚合物結(jié)構(gòu)構(gòu)建高亮度短波紅外發(fā)射色烯鎓熒光團(tuán)，命名為色烯鎓星（或稱"CStars"）。在聚合物屏蔽染料中，含五條POx鏈的變體（CStar30）具有顯著增強(qiáng)的水溶性與短波紅外亮度，可實現(xiàn)小鼠體內(nèi)高分辨率短波紅外成像；其體內(nèi)展現(xiàn)的快速腎臟清除特性與隱匿行為還實現(xiàn)了淋巴系統(tǒng)無創(chuàng)可視化效果的提升。此外，CStar與FDA批準(zhǔn)染料吲哚菁綠（ICG）促進(jìn)雙色激發(fā)復(fù)用短波紅外成像，可在視頻速率幀數(shù)下實時同步觀測同一活體內(nèi)的流體動力學(xué)與蛋白質(zhì)動力學(xué)。

 

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本研究融合隱形聚合物與短波紅外發(fā)射聚甲炔熒光團(tuán)優(yōu)勢，采用精確設(shè)計的星形聚合物結(jié)構(gòu)以保持造影劑的分子級離散性。星形聚合物以共同核心延伸出三條及以上聚合物鏈（"臂"）為特征，相比線性聚合物具有鏈纏結(jié)少、溶液粘度低等獨特性質(zhì)。通過在星形聚合物核心植入短波紅外發(fā)射熒光團(tuán)，推斷聚合物臂既能提供水溶性和體內(nèi)隱形特性，又可作為分子屏障保護(hù)水環(huán)境中的熒光團(tuán)。由此開發(fā)出色烯鎓星形聚合物"CStars"：其核心為高亮度色烯鎓熒光團(tuán)，外圍延伸隱形親水性聚(2-甲基-2-噁唑啉)（POx）聚合物臂（圖1B）。將該材料與吲哚菁綠（ICG）聯(lián)用，最終實現(xiàn)小鼠體內(nèi)雙色激發(fā)復(fù)用短波紅外成像，通過降低蛋白結(jié)合率顯著改變體內(nèi)生物分布與清除速率（圖1C）。

 

圖1. 用于體內(nèi)成像的聚甲氧基熒光團(tuán)

 

本研究選用具有優(yōu)異短波紅外亮度的七甲川色烯鎓熒光團(tuán)（Chrom7）作為CStars核心。通過結(jié)構(gòu)修飾，使核心色烯鎓骨架攜帶3-5個末端炔基，以便通過銅催化點擊化學(xué)進(jìn)行聚合物偶聯(lián)。隱形聚合物臂選用疊氮功能化線性聚(2-甲基-2-噁唑啉)（POx），由對應(yīng)單體聚合而成。本研究聚焦聚合度30的POx鏈，因其在膠束和納米乳劑中展現(xiàn)卓越親水性。采用"耦合接枝"策略將核心熒光團(tuán)與聚合物臂結(jié)合——先獨立制備各組分再偶聯(lián)，成功制得分子量分布狹窄的星形聚合物（圖2A）。盡管大分子聚合物偶聯(lián)動力學(xué)緩慢，但銅催化疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)（CuAAC）在此展現(xiàn)出高效性。

 

圖2. 點擊化學(xué)法合成鉻烯基星形聚合物（CStars）

 

為探究星形結(jié)構(gòu)對染料性能的影響，制備了三種含不同炔基數(shù)目的核心熒光團(tuán)。通過CuAAC反應(yīng)高效合成了分子量分布極窄（Đ≤1.02）的CStars（5,6,7），分別含五臂、四臂及三臂POx鏈（圖2B,）。以5號材料優(yōu)化反應(yīng)條件發(fā)現(xiàn)：當(dāng)每炔基配2當(dāng)量POx聚合物及16% Cu(I)催化劑時，反應(yīng)數(shù)小時內(nèi)即可完全轉(zhuǎn)化。凝膠滲透色譜（GPC）、基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜（MALDI）（圖2C-E）分析表明偶聯(lián)反應(yīng)高效穩(wěn)定，不同批次產(chǎn)物重現(xiàn)性優(yōu)異。隨著聚合物臂數(shù)量減少，尺寸排阻色譜與透析分離難度增加，導(dǎo)致分離收率逐步降低。

圖3. CStars和核心熒光團(tuán)的光物理性質(zhì)

 

在獲得五臂、四臂及三臂CStars材料（5–7）后，選用極性更強(qiáng)的甲醇（MeOH）直接對比核心熒光團(tuán)與CStars亮度。值得欣慰的是，所有CStars均保持聚甲炔特征吸收/發(fā)射光譜，且相較對應(yīng)核心熒光團(tuán)產(chǎn)生約10 nm紅移（最大吸收波長λmax, abs∼ 940 nm）。核心熒光團(tuán)亮度（ΦF X εmax）在所有CStars中也得以維持或提升（圖3D）。這些數(shù)據(jù)共同表明：聚合物臂在改變核心熒光團(tuán)溶解性的同時，能保留理想光物理特性。隨后評估了CStars結(jié)構(gòu)抑制非輻射聚集并傳遞亮度至水相的能力。濃度匹配實驗顯示：吸收光譜隨臂數(shù)變化（圖3A），而發(fā)射光譜保持穩(wěn)定（圖3B）。三臂CStar（7）在任何測試濃度下均未能實現(xiàn)單體發(fā)光型水相吸收譜。對比五臂與四臂CStars（5和6）在水中的光物理參數(shù)，5號材料憑借更高εmax與ΦF占據(jù)優(yōu)勢（圖3D）。為直接對比水相短波紅外相對亮度，在974 nm激發(fā)下測量了毛細(xì)管中濃度匹配的各CStars變體發(fā)射強(qiáng)度。與光物理測量結(jié)果一致，5號材料在1100 nm以上波段展現(xiàn)出最強(qiáng)短波紅外發(fā)射強(qiáng)度（圖3C）。綜上可得出結(jié)論：五條聚合物臂在最大化水溶性及亮度方面最為理想，遂將五臂色烯鎓星形聚合物（5）命名為CStar30，其中"30"代表每條POx聚合物臂所含MeOx重復(fù)單元數(shù)。

圖4. CStar30和SulfoChrom7在水和蛋白質(zhì)溶液中的比較（光物理性質(zhì)見圖3D）

 

接下來研究者評估了CStar30抵抗蛋白結(jié)合的能力。首先在純水和富含白蛋白及其他生物分子的胎牛血清（FBS）中檢測CStar30和SulfoChrom7（圖4）。令人振奮的是，CStar30在純水與FBS中均呈現(xiàn)單體吸收特征（圖4A），且短波紅外發(fā)射強(qiáng)度近乎一致（圖4C）。更重要的是，CStar30在純水中優(yōu)異的光物理性質(zhì)在FBS環(huán)境中依然保持穩(wěn)定（圖3D）。相反，SulfoChrom7從純水到FBS環(huán)境中吸收光譜與短波紅外發(fā)射強(qiáng)度發(fā)生劇烈變化：其在純水中非輻射聚集占據(jù)主導(dǎo)，導(dǎo)致短波紅外發(fā)射近乎消失，而FBS環(huán)境則恢復(fù)了其發(fā)光單體狀態(tài)（圖4B,4D）。既往研究表明ICG存在類似現(xiàn)象。

生物環(huán)境穩(wěn)定性對小分子染料而言歷來是嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。前期研究顯示ICG和SulfoChrom7在生理溫度（37°C）下僅數(shù)小時即從溶液中大量降解。值得慶幸的是，CStar30在純水和FBS中的穩(wěn)定性均顯著提升。特別是在谷胱甘肽（GSH）存在下，其穩(wěn)定性大幅增強(qiáng)：1 mM GSH中20天后仍保留50%以上熒光團(tuán)，10 mM GSH中更可持續(xù)55天。此外在相同條件下，CStar30在純水與FBS溶液中的光漂白速率較SulfoChrom7提升約10倍（圖4E）。綜上所述，CStar30的星形聚合物結(jié)構(gòu)能更有效屏蔽水環(huán)境對熒光團(tuán)的影響，其化學(xué)穩(wěn)定性與光穩(wěn)定性均顯著優(yōu)于易結(jié)合蛋白的染料。

圖5. 小鼠CStar30的單色成像

 

在確認(rèn)CStar30具備優(yōu)異體外性能后，研究者進(jìn)一步開展小鼠活體短波紅外成像實驗（圖5）。首次活體實驗采用尾靜脈注射CStar30（圖5A），立即觀察到腎臟富集現(xiàn)象（圖5B），隨時間推移膀胱信號持續(xù)增強(qiáng)。麻醉狀態(tài)下靜脈注射后血液循環(huán)時間估測為10-15分鐘。值得注意的是，當(dāng)小分子聚甲炔染料因蛋白結(jié)合作用主要富集于肝臟時，CStar30在肝臟僅呈現(xiàn)基礎(chǔ)信號（圖5E,5F），提示其具有體內(nèi)隱形特性。注射3小時后整體信號顯著減弱，1天后基本檢測不到。處死動物后離體器官微弱熒光強(qiáng)度與探針主體已清除的結(jié)果一致。

基于獨特的體內(nèi)分布與快速清除特性，通過后足墊皮內(nèi)注射將CStar30引入淋巴系統(tǒng)（圖5C）。皮內(nèi)注射后，CStar30使淋巴結(jié)清晰顯影，結(jié)合高分辨率短波紅外檢測窗口實現(xiàn)了無創(chuàng)淋巴結(jié)識別（圖5D,5G）�；铙w實時監(jiān)測顯示染料在淋巴管中的脈動傳輸，麻醉狀態(tài)下淋巴引流速度計算值約2.5 mm/min（圖5H）。盡管既往熒光淋巴成像研究在淋巴結(jié)識別與引流速度方面存在較大差異，研究者認(rèn)為CStar30能最大限度減少與蛋白質(zhì)及其他生物分子的非特異性相互作用，從而更精準(zhǔn)呈現(xiàn)淋巴動力學(xué)過程。

圖6. CStar30和ICG在小鼠體內(nèi)的雙色激發(fā)多路成像

 

為深入探究蛋白結(jié)合型與蛋白惰性熒光團(tuán)在活體動力學(xué)的差異，采用ICG（蛋白結(jié)合型染料）與CStar30（蛋白惰性染料）進(jìn)行激發(fā)多路復(fù)用雙色成像（圖6A）。選擇ICG因其光譜與CStar30分離，可分別通過786 nm和974 nm交替激發(fā)，在單一短波紅外發(fā)射窗口實現(xiàn)雙通道檢測（圖6B）。該方法支持視頻級成像速度的雙熒光團(tuán)同步觀測。盡管ICG主要發(fā)射近紅外光，其微弱發(fā)射尾跡仍可在短波紅外波段顯現(xiàn)（需更高注射濃度）。最終確定15:100 μM（CStar30）的濃度比可有效消除激發(fā)通道串?dāng)_（圖6C），為活體雙色成像奠定基礎(chǔ)。

通過靜脈或皮下共注射兩種染料，研究者在同一動物體內(nèi)直接比較熒光團(tuán)的分布動力學(xué)與清除時程。靜脈注射后，ICG在2分鐘內(nèi)流經(jīng)血管并富集于肝臟（符合蛋白結(jié)合特性），而聚合物屏蔽的CStar30則同時抵達(dá)腎臟（圖6D）。麻醉狀態(tài)下持續(xù)監(jiān)測30分鐘發(fā)現(xiàn)：ICG肝臟信號持續(xù)增強(qiáng)（圖6D藍(lán)色），CStar30腎臟信號在10分鐘開始下降，30分鐘時膀胱積聚最顯著（圖6D洋紅色）。注射3小時后，ICG在肝臟、胃腸呈現(xiàn)強(qiáng)信號，而CStar30腎臟信號趨近于零，膀胱殘留微弱。1天后CStar30信號完全消失，但I(xiàn)CG在注射2天后仍于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（如肝臟）清晰可見（圖6D藍(lán)色），此為蛋白結(jié)合型染料的典型滯留特征。皮下共注射實驗顯示：兩種染料初期均富集于相同淋巴結(jié)（圖6E紫色），但I(xiàn)CG同步轉(zhuǎn)移至肝臟（圖6E藍(lán)色），而CStar30淋巴結(jié)滯留時間延長（注射后10分鐘內(nèi)腎臟/膀胱信號微弱）。其淋巴結(jié)強(qiáng)信號可持續(xù)1小時（圖S29,S30），而ICG在注射2天后仍滯留于網(wǎng)狀內(nèi)皮組織（圖6E藍(lán)色），CStar30則完全無法檢測。該結(jié)果證實蛋白結(jié)合會導(dǎo)致ICG干擾淋巴結(jié)定位及淋巴引流監(jiān)測的時效性。

 

本研究將隱形親水性線性POx聚合物與短波紅外發(fā)射色烯鎓七甲炔熒光團(tuán)融合，開發(fā)了出色的烯鎓星形聚合物（CStars）。評估維持水中短波紅外熒光核心亮度所需聚合物臂數(shù)量時，發(fā)現(xiàn)五臂構(gòu)型最優(yōu)，該修飾還極大提升了水環(huán)境下的化學(xué)穩(wěn)定性與光穩(wěn)定性�；�于五臂結(jié)構(gòu)（CStar30），星形聚合物在體外排斥蛋白相互作用，表現(xiàn)為純水與蛋白溶液中吸收光譜及短波紅外亮度的差異可忽略。作為該類別首例，研究者將CStar30通過靜脈與皮下注射應(yīng)用于小鼠活體短波紅外成像，欣喜觀察到染料獨立于注射方式快速經(jīng)腎臟清除——此為該類染料首次突破肝臟積聚瓶頸。皮下注射中還能實時監(jiān)測淋巴結(jié)引流（疾病狀態(tài)的重要生物學(xué)標(biāo)志），并在與ICG的激發(fā)多路復(fù)用成像實驗中，揭示星形聚合物架構(gòu)相較蛋白結(jié)合小分子染料的體內(nèi)分布與動力學(xué)差異。最終攻克水溶性短波紅外聚甲炔熒光團(tuán)的生物分子互作壁壘，CStar架構(gòu)有望顯著推進(jìn)無創(chuàng)臨床實踐（如腎功能與淋巴引流監(jiān)測），且借助POx聚合物臂的可合成性，該策略可適配多種熒光團(tuán)骨架。

 

參考文獻(xiàn)

Mobley E B, Lin E Y, Sletten E M. Chromenylium star polymers: Merging water solubility and stealth properties with shortwave infrared emissive fluorophores[J]. ACS Central Science, 2024.

 

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