用于腫瘤浸潤性T細(xì)胞LAG3檢查點(diǎn)表達(dá)的免疫pet成像的構(gòu)建

文獻(xiàn)信息
北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所，核醫(yī)學(xué)科，國家藥監(jiān)局放射性藥物研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究成果Construction of [⁸⁹Zr]Zr-Labeled HuL13 for ImmunoPET Imaging of LAG‑3 Checkpoint Expression on Tumor-Infiltrating T Cells（[⁸⁹Zr] zr標(biāo)記的HuL13用于腫瘤浸潤性T細(xì)胞LAG‑3檢查點(diǎn)表達(dá)的免疫PET成像的構(gòu)建）在學(xué)術(shù)期刊《MOLECULAR PHARMACEUTICS》發(fā)表。平生公司的小動物PET/CT（型號：Super Nova）產(chǎn)品在論文中提供了重要的腫瘤小鼠PET/CT圖像和定量分析。

該研究的通訊作者為北腫楊志主任，朱華研究員。第一作者為丁立新。

文獻(xiàn)背景
摘要:淋巴細(xì)胞活化基因3 (LAG-3)作為一種具有潛在價(jià)值的免疫檢查點(diǎn)受到了廣泛關(guān)注。在篩查和治療過程中對LAG-3表達(dá)的個(gè)體鑒定可以提高抗LAG-3治療的成功實(shí)施。HuL13是一種人IgG1單克隆抗體，可與T細(xì)胞中的LAG-3受體結(jié)合。在這里，作者使用[⁸⁹Zr] ZR標(biāo)記的HuL13通過正電子發(fā)射斷層掃描(PET)成像來描繪LAG-3+t細(xì)胞浸潤腫瘤。通過慢病毒感染獲得了穩(wěn)定表達(dá)LAG-3的A549/LAG-3細(xì)胞。各時(shí)間點(diǎn)A549/LAG-3細(xì)胞對[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13的攝取均大于陰性對照(A549/NC)細(xì)胞。[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13對LAG-3受體的平衡解離常數(shù)(Kd)為8.22 nM。PET成像顯示，注射后24小時(shí)，A549/LAG-3荷瘤小鼠腫瘤區(qū)域有明顯攝取(24小時(shí)時(shí)SUVmax=2.43±0.06)。作為概念證明，作者在MC38荷瘤人源化LAG-3小鼠模型中進(jìn)一步研究了[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13示蹤劑的PET成像。PET顯像顯示[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13示蹤劑特異性靶向腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TILs)上表達(dá)的人LAG-3。除腫瘤外，脾臟也明顯可見。腫瘤對[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13示蹤劑的攝取低于其在脾臟中的攝取，但通過聯(lián)合注射未標(biāo)記抗體可以降低其在脾臟中的高攝取。未標(biāo)記抗體的共注射增加了血液池中示蹤劑的活性，從而改善了腫瘤的攝取。健康小鼠模型的劑量學(xué)評價(jià)顯示，脾臟吸收輻射劑量最高，其次是肝臟和心臟壁。綜上所述，這些研究證明了使用[89Zr]Zr-DFO-HuL13示蹤劑檢測TILs上LAG3表達(dá)的可行性。[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13示蹤物的進(jìn)一步臨床評價(jià)可能對適合抗LAG-3治療的患者的分層和管理有重要幫助。

實(shí)驗(yàn)方法
動物模型建立
BALB/c裸鼠(雌性，5~6周齡)和KM小鼠(雌性，20g體重)。B6-hLAG-3小鼠(雌性，5-6周齡)，人源化LAG-3敲入小鼠。將A549/LAG3細(xì)胞(100μLPBS為5×10⁶)或A549/NC細(xì)胞(100μL PBS為5×10⁶)皮下接種于裸鼠右肩。將MC38細(xì)胞(1×10⁶/100μLPBS)皮下注射至B6hLAG-3小鼠右肩，建立荷瘤hLAG-3(MC38/hLAG-3)小鼠模型。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到100~300mm3時(shí)，進(jìn)行PET成像。

PET成像與生物分布研究
用異氟醚麻醉荷瘤小鼠(n=3)，并靜脈注射[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13 (3.7MBq/200μL PBS)。在注射后2、24、48、72和96h使用小動物PET掃描儀(Super Nova PET/CT, PINGSENG, Shanghai, China)進(jìn)行PET成像。[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13的特異性通過以60:1的摩爾比共注射未標(biāo)記抗體在載瘤hLAG-3小鼠模型中進(jìn)行評估。使用有序子集期望最大化(OSEM)重建PET圖像，并使用Avatar軟件(平生醫(yī)療科技有限公司)進(jìn)一步分析。在器官和腫瘤組織中繪制感興趣區(qū)域(ROI)，并使用最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值(SUVmax)來量化示蹤劑的攝取。PET顯像后，處死小鼠，收集主要臟器和腫瘤，稱重，用γ-計(jì)數(shù)器測定放射性。結(jié)果以% ID/g表示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13在A549/LAG3和A549/NC腫瘤模型中的PET成像為了證明[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13在體內(nèi)的特異性，作者使用攜帶高水平穩(wěn)定表達(dá)LAG-3的A549/LAG-3腫瘤和A549/NC腫瘤的BALB/c裸鼠作為對照。A549/LAG-3和A549/NC腫瘤模型的代表性微PET/CT圖像(注射后2、24、48、72和96h)如圖3A所示。根據(jù)ROI的劃定和量化，注射后各選擇時(shí)間，A549/LAG-3荷瘤小鼠腫瘤區(qū)域的SUVmax明顯高于對照A549/NC荷瘤小鼠(圖3B)。[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13示蹤劑在A549/LAG-3荷瘤小鼠的腫瘤區(qū)域連續(xù)積累96h(2h時(shí)SUVmax值為1.13 ± 0.05; 24h時(shí)2.43 ± 0.06; 48h時(shí)3.89 ± 0.04; 72h時(shí)4.61 ± 0.04; 4.92 ± 0.06(96h))，但在A549/NC荷瘤小鼠的腫瘤區(qū)域沒有(圖3B)。

圖3.[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13在A549/LAG-3和A549/NC腫瘤模型中的作用(A)注射[⁸⁹Zr] Zr-DFOS-HUL13示蹤劑(3.7MBq/200μL)后2、24、48、72和96 h在A549/LAG-3和A549/NC腫瘤模型中具有代表性的微PET/CT圖像。白色圓圈顯示的區(qū)域表示腫瘤。(B) A組影像中腫瘤感興趣區(qū)域(ROI)量化(n=3)。

[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13在MC38荷瘤人源化LAG-3小鼠模型中的PET成像為了證明這一概念，作者描述了[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13在正常和A549/ LAG-3荷瘤小鼠中的PET成像和生物分布。將106個(gè)MC38細(xì)胞接種到人源化LAG-3小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞。因此，作者采用MC38/hLAG-3小鼠模型來評價(jià)[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13示蹤劑對腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的顯像效果。MC38/hLAG-3小鼠模型的代表性微PET/CT圖像(注射后2、24、48、72和96 h)如圖4A所示。PET/CT成像顯示[⁸⁹Zr]ZrDFO-HuL13在腫瘤中攝取，但也在健康組織(如脾臟)中攝取，這與脾臟致密的淋巴組織組成相一致。各器官的SUVmax為通過從PET圖像中勾畫ROI來確定。在該模型中，腫瘤區(qū)域的SUVmax在24h時(shí)達(dá)到最大值3.22±0.09,96h時(shí)逐漸降低至1.22±0.07，而脾臟的SUVmax在72 h內(nèi)繼續(xù)升高，在72h時(shí)達(dá)到最大值11.66±0.27(圖4B)。在共注射過量未標(biāo)記HuL13的阻斷組中，腫瘤和脾臟的攝取被阻斷(24h時(shí)SUVmax值為1.84±0.06 vs 3.22±0.09,P<0.001)，證實(shí)了示蹤劑對TILs上表達(dá)的LAG-3的特異性(圖4C)。

圖4 [⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13在MC38異體人源LAG-3小鼠模型中的應(yīng)用(A)注射[⁸⁹Zr] Zr-DFO-HuL13示蹤劑(3.7MBq/200μL，單獨(dú)注射示蹤劑或以60:1的摩爾比聯(lián)合注射過量未標(biāo)記的HuL13)后2、24、48、72和96h, MC38人源化LAG-3小鼠的代表性微PET /CT圖像。S=脾臟;T=腫瘤。(B, C)各組器官感興趣區(qū)域(ROI)定量(n=3)。

文獻(xiàn)結(jié)論
本研究開發(fā)了一種新型放射性示蹤劑[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13，用于腫瘤浸潤性T細(xì)胞LAG-3檢查點(diǎn)表達(dá)的免疫pet成像。[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13具有良好的放化產(chǎn)率、良好的體外穩(wěn)定性和對人LAG-3的高親和力。此外，[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13在穩(wěn)定表達(dá)LAG-3的A549模型中表現(xiàn)出優(yōu)越的腫瘤靶向特性，并與MC38載瘤人源化LAG-3小鼠模型的特異性免疫PET成像非常匹配。作者也證實(shí)了脾臟作為一個(gè)降低腫瘤靶向的器官。共注射未標(biāo)記抗體使脾臟攝取飽和，提高腫瘤靶向性�？傊�，作者的研究證明了[⁸⁹Zr]Zr-DFO-HuL13在抗LAG-3治療前和治療過程中個(gè)體識別LAG-3表達(dá)的潛力，這對精確腫瘤治療的重要性不斷增加。

使用設(shè)備

Super Nova^® Micro PET/CT（III 代外觀圖