Blasticidin S的作用機(jī)制及在構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株、抗植物病害等中的應(yīng)用

Blasticidin S（殺稻瘟菌素S，AbMole，M9163）是一種從灰色產(chǎn)色鏈霉菌（Streptomyces griseochromogenes）發(fā)酵液中分離獲得的核苷類抗生素，對細(xì)菌、真菌、酵母、植物及哺乳動物細(xì)胞等具有廣泛的抑制活性。在分子生物學(xué)研究中，Blasticidin S常被用作篩選標(biāo)記，用于篩選攜帶特定抗性基因（如BSD或BSR基因）的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。Blasticidin S在水稻等農(nóng)作物的真菌感染和腫瘤抑制等方向也有一定的應(yīng)用潛力。AbMole為全球科研客戶提供高純度、高生物活性的抑制劑、細(xì)胞因子、人源單抗、天然產(chǎn)物、熒光染料、多肽、靶點蛋白、化合物庫、抗生素等科研試劑，全球大量文獻(xiàn)專利引用。

一、Blasticidin S的作用機(jī)制
Blasticidin S（殺稻瘟菌素S，AbMole，M9163）主要通過合核糖體大亞基的肽基轉(zhuǎn)移酶中心，來特異性抑制原核和真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成。具體而言，Blasticidin S能干擾肽酰-tRNA的水解過程，從而抑制肽鍵的形成。同時Blasticidin S還可以干擾釋放因子eRF1進(jìn)入肽基轉(zhuǎn)移酶中心，這使得新生肽鏈無法釋放。綜上，Blasticidin S可從多個環(huán)節(jié)阻斷蛋白質(zhì)合成，最終導(dǎo)致細(xì)胞因無法正常合成蛋白質(zhì)而生長停滯甚至死亡^[1]。
二、Blasticidin S（殺稻瘟菌素）的科研應(yīng)用
1. Blasticidin S（BlaS）用于構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株實驗
在細(xì)胞生物學(xué)和分子遺傳學(xué)研究中，Blasticidin S廣泛應(yīng)用于篩選攜帶抗性基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。Blasticidin S（殺稻瘟菌素S，AbMole，M9163）的抗性基因主要有BSD基因和BSR基因。BSD基因來源于土曲霉（Aspergillus terreus）。該基因編碼一種Blasticidin S脫氨酶，能夠催化Blasticidin S的脫氨反應(yīng)，從而使其失去活性；BSR基因來源于蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。該基因同樣編碼一種Blasticidin S脫氨酶，其作用機(jī)制與BSD基因類似。在實際操作中，一般可以通過DNA重組技術(shù)，如使用無縫克隆、DNA連接酶等方法將需要轉(zhuǎn)染的外源基因整合到帶有BSD或者BSR基因的載體上，隨后轉(zhuǎn)染細(xì)胞并進(jìn)行抗性篩選。
對于哺乳動物細(xì)胞而言，Blasticidin S（殺稻瘟菌素S，AbMole，M9163）常用的篩選濃度為1-50 μg/mL，如暫不清楚最佳篩選濃度，則需進(jìn)行預(yù)實驗以構(gòu)建滅殺曲線。將未轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于24孔、12孔或者6孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)60 %時加入含不同濃度的Blasticidin S培養(yǎng)基，濃度梯度可以設(shè)置成0、5、10、15、20μg/mL（或擴(kuò)展至50 μg/mL），每2天更換含Blasticidin S的培養(yǎng)基，一周左右可殺死大于90%細(xì)胞的最低濃度為最佳篩選濃度。2014年，AbMole的兩款抑制劑分別被西班牙國家心血管研究中心和美國哥倫比亞大學(xué)用于動物體內(nèi)實驗，相關(guān)科研成果發(fā)表于頂刊 Nature 和 Nature Medicine。

在確定最佳篩選濃度后，即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染，一般在轉(zhuǎn)染后的48小時即可進(jìn)行篩選，注意轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種數(shù)量不宜過多，否則會影響后續(xù)的Blasticidin S篩選效率，通常接種時的覆蓋率為25%左右；此外，處于分裂旺盛期的細(xì)胞最適合Blasticidin S進(jìn)行篩選，一般匯合度為70-80%。在篩選過程中每2天去除培養(yǎng)基，加入含Blasticidin S（殺稻瘟菌素S，AbMole，M9163）的新鮮培養(yǎng)基，篩選周期為一周左右，待對照組細(xì)胞全部死亡后，即可對存活的陽性細(xì)胞進(jìn)行抗性驗證、擴(kuò)增和凍存。
Blasticidin S（殺稻瘟菌素S，AbMole，M9163）除了用于哺乳動物細(xì)胞的篩選外，還能用于細(xì)菌甚至藻類的篩選，包括大腸桿菌和某些藻類細(xì)胞，例如萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）。Blasticidin S在固體或者液體培養(yǎng)環(huán)境中均能有效抑制萊茵衣藻的生長，其最小抑制濃度為50 μg/mL^[2]。
2. Blasticidin S用于其它實驗
水稻病害抑制：作為首個取代汞制劑的生物源抑制劑，Blasticidin S（殺稻瘟菌素S，AbMole，M9163）廣泛用于防治稻瘟病（Magnaporthe oryzae）。其通過抑制真菌蛋白質(zhì)合成，阻斷孢子萌發(fā)與菌絲擴(kuò)展，有效降低病害傳播^[3]。
腫瘤細(xì)胞抑制研究：Blasticidin S（殺稻瘟菌素S，AbMole，M9163）可抑制部分腫瘤細(xì)胞系（如B16、U87MG、BaF3）的增殖^[4]，為抗腫瘤抑制方案提供更多思路。
蛋白質(zhì)合成抑制機(jī)制研究：Blasticidin S（殺稻瘟菌素S，AbMole，M9163）通過特異性結(jié)合核糖體，干擾肽鍵形成并抑制肽基-tRNA水解，被廣泛用于探索蛋白質(zhì)合成的分子機(jī)制。其作用位點明確，是研究翻譯終止、核糖體功能的經(jīng)典工具。

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參考文獻(xiàn)及鳴謝
[1] K. T. Powers, F. Stevenson-Jones, S. K. N. Yadav, et al., Blasticidin S inhibits mammalian translation and enhances production of protein encoded by nonsense mRNA, Nucleic acids research 49(13) (2021) 7665-7679.
[2] F. de Carpentier, J. Le Peillet, N. D. Boisset, et al., Blasticidin S Deaminase: A New Efficient Selectable Marker for Chlamydomonas reinhardtii, Frontiers in plant science 11 (2020) 242.
[3] P. C. Ceresini, V. L. Castroagudín, FÁ Rodrigues, et al., Wheat Blast: Past, Present, and Future, Annual review of phytopathology 56 (2018) 427-456.
[4] N. Ishiyama, M. O'Connor, A. Salomatov, et al., Computational and Functional Analyses of HER2 Mutations Reveal Allosteric Activation Mechanisms and Altered Pharmacologic Effects, Cancer research 83(9) (2023) 1531-1542.