陰離子層析（AEX）的病毒去除表現(xiàn)以及影響因素

病毒污染是使用源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的生物技術(shù)產(chǎn)品的潛在風(fēng)險(xiǎn)。生產(chǎn)過程中，無(wú)論處于臨床前非GMP、臨床GMP或商業(yè)化階段，均可能受到內(nèi)源性或外源性病毒的污染，對(duì)患者安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。據(jù)統(tǒng)計(jì)，過去36年間共報(bào)告了26起哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的病毒污染事件，其發(fā)生在產(chǎn)品生命周期的所有階段。因此，確保產(chǎn)品病毒安全性是行業(yè)監(jiān)管與工藝開發(fā)的核心關(guān)注點(diǎn)。

為了保證這些產(chǎn)品在潛在病毒污染方面的安全性，監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求進(jìn)行病毒清除研究，以評(píng)估純化過程清除內(nèi)源性和外源性病毒的能力。一般來(lái)說(shuō)，下游工藝減少病毒是通過柱層析和專用的病毒去除步驟（即低pH值孵育、去污劑處理和納濾）來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本文將簡(jiǎn)述陰離子層析（Anion exchange chromatography, AEX）病毒去除效果及影響因素。

• 流穿模式 (Flow Through Mode, FT)：此模式利用目標(biāo)單抗與模型病毒等電點(diǎn)（pI）的差異。多數(shù)單抗pI較高，在適宜的緩沖液條件下（pH 7.0~8.5，低電導(dǎo)率），單抗因帶正電荷而流穿；而模型病毒（如X-MuLV pI~5.8, MVM pI~6.2）在此條件下帶負(fù)電荷，通過與填料帶正電荷的配基發(fā)生靜電吸附而被去除。

• 結(jié)合-洗脫模式 (Bind and Elute Mode, B/E)：此模式則利用單抗與病毒在結(jié)合力強(qiáng)度上的差異。在特定條件下，單抗和病毒均結(jié)合至填料上，隨后通過改變洗脫條件，選擇性地洗脫單抗，而病毒仍保留在填料上。

• 約70%的AEX應(yīng)用采用FT模式，約30%采用B/E模式。
• FT模式對(duì)兩種病毒表現(xiàn)出較高的穩(wěn)健性，且批次間變異性較低。
• B/E模式對(duì)兩種病毒的清除能力呈現(xiàn)更高的批次間變異性。
• 兩種模式下細(xì)小病毒批次間變異性均大于逆轉(zhuǎn)錄病毒。

Fig.1 陰離子交換層析對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒和細(xì)小病毒的去除能力總結(jié)（FDA數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)）

• 增強(qiáng)緩沖液的兼容性：可在更寬的pH值和電導(dǎo)率范圍內(nèi)有效運(yùn)行。

• 更穩(wěn)健的病毒清除：如Fig.2所示，與單一模式AEX相比，復(fù)合模式AEX在高鹽條件下仍能維持優(yōu)異的細(xì)小病毒去除效能（在高鹽區(qū)仍保持較高LRV）。

Fig.2 復(fù)合模式陰離子層析 vs. 單一陰離子層析對(duì)細(xì)小病毒的去除能力比較（FDA數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)）

• pH值：病毒-AEX的相互作用為靜電，但在低鹽條件下，X-MuLV在不同pH下清除效果比較穩(wěn)定，X-MuLV和AEX填料之間的相互作用在5.0~8.0的范圍內(nèi)僅略微依賴于pH值。與X-MuLV 清除率不同，不同pH值的MVM(pI 6.2)去除符合預(yù)期，當(dāng)50 mM氯化鈉的pH值從5增加到8時(shí)，LRV大約增加4。
• 離子強(qiáng)度：對(duì)于單一的陰離子層析，通常隨著鹽濃度增加，病毒去除效果逐漸降低。而復(fù)合模式層析受鹽濃度影響較小，由Fig.2可知。
• Mab性質(zhì)：對(duì)于任何給定類型的色譜分析，特定病毒的清除率不僅受色譜形成條件的影響，還受目標(biāo)mAb本身的影響，病毒可以通過其表面負(fù)電荷與帶正電荷的mAb相互作用，從而影響病毒的去除效果。
• 病毒種類：X-MuLV的pI為5.8，該現(xiàn)象（X-MuLV在pH值為5時(shí)與AEX介質(zhì)結(jié)合）是不正常的，表明該病毒在該pH值時(shí)其表面仍舊含有帶負(fù)電荷的斑塊�？芍猵I是預(yù)測(cè)病毒等大型復(fù)雜結(jié)構(gòu)與離子交換（IEX）填料相互作用是不足的。相反，在確定病毒-IEX 填料相互作用方面，病毒表面電荷分布比 pI 更相關(guān)。

綜上可知，陰離子層析對(duì)病毒的去除效果受到多種因素影響，因此為獲得穩(wěn)健的病毒清除效果，單一模式陰離子層析建議pH 值為7.0~8.5、電導(dǎo)率<10 mS/cm和載量<100 mg/ml。

• 高效清除能力：在某項(xiàng)目中，針對(duì)多種包膜和非包膜病毒模型（X-Mulv, MVM, PRV, Reo3）Diamond MIX-A展現(xiàn)出優(yōu)異的清除能力，LRV范圍達(dá)4.5-5.34 log。
• 卓越耐鹽性：在極具挑戰(zhàn)性的高鹽條件下（上樣電導(dǎo)22 mS/cm, pH 6.43, 載量~60 mg/mL），保留時(shí)間（5 min），Diamond MIX-A對(duì)X-Mulv仍實(shí)現(xiàn)了顯著的清除效果，LRV分別達(dá)到3.04 log、3.25 log，驗(yàn)證了其在高鹽環(huán)境下的穩(wěn)健性。

下表匯總了Diamond Q系列填料在多個(gè)單抗項(xiàng)目中對(duì)模型病毒X-MuLV和MVM的清除表現(xiàn)：

• Diamond Q對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒X-MuLV展現(xiàn)出高度一致且優(yōu)異的清除能力（所有項(xiàng)目LRV≥4 log）。
• 對(duì)細(xì)小病毒MVM的清除能力存在一定的項(xiàng)目間變異性（LRV范圍從2~5 log），這也印證了前文所述。盡管如此，在多數(shù)項(xiàng)目中仍能達(dá)到≥3 log的有效清除。
• Diamond Q Mustang 在測(cè)試項(xiàng)目中同樣表現(xiàn)出良好的病毒清除能力。

然而，即使是通常被認(rèn)為穩(wěn)健的AEX步驟，其清除效果（特別是對(duì)細(xì)小病毒）也可能因目標(biāo)Mab的特異性、工藝參數(shù)的選擇而存在差異。復(fù)合模式AEX填料（如Diamond MIX-A）因其結(jié)合了多種作用力，在高鹽條件下展現(xiàn)出更穩(wěn)健的病毒清除性能。

為確保病毒清除的穩(wěn)健性，需在經(jīng)過驗(yàn)證的操作參數(shù)范圍內(nèi)運(yùn)行AEX。病毒清除研究應(yīng)使用代表性的模型病毒，并在工藝最差條件的情況下進(jìn)行，以充分證明該步驟在各種潛在風(fēng)險(xiǎn)場(chǎng)景下均能提供可靠且符合監(jiān)管要求的病毒去除能力。

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關(guān)于博格隆
博格隆成立于2008年，是一家專注于為分離純化提供高質(zhì)量層析介質(zhì)的高新技術(shù)企業(yè)，是中國(guó)較早具備大規(guī)模生產(chǎn)分離純化介質(zhì)能力的企業(yè)之一。博格隆所提供的產(chǎn)品涵蓋各類分離純化介質(zhì)、預(yù)裝柱、實(shí)驗(yàn)室及工業(yè)生產(chǎn)級(jí)空柱、微載體，同時(shí)提供分離純化工藝開發(fā)服務(wù)及填料定制。