從干細(xì)胞到神經(jīng)細(xì)胞——調(diào)控子如何 “繪制” 神經(jīng)系統(tǒng)的多樣性

圖1. NGN2-iN神經(jīng)元亞型組合模式化篩選

(A) NGN2-iN組合模式化篩選實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與時(shí)間線，采用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(snRNA-seq)結(jié)合分池組合條形碼技術(shù)(Parse Biosciences)分析192種形態(tài)發(fā)生素組合。(B) 184,431個(gè)細(xì)胞的UMAP降維圖，按細(xì)胞簇(左)和AP/DV形態(tài)發(fā)生素來(lái)源(右)著色。(C) 代表性標(biāo)志基因表達(dá)特征圖。(D) 模式化NGN2-iN細(xì)胞簇的標(biāo)記基因、轉(zhuǎn)錄因子和離子通道表達(dá)熱圖。(E) 基于原代神經(jīng)元參考圖譜注釋的UMAP圖，顯示神經(jīng)系統(tǒng)分區(qū)(左上)、區(qū)域(右上)、神經(jīng)元類型(左下)和匹配評(píng)分(右下)。縮寫(xiě)：CNS中樞神經(jīng)系統(tǒng)；PNS外周神經(jīng)系統(tǒng)；SYM交感神經(jīng)系統(tǒng)；ENS腸神經(jīng)系統(tǒng)；TG三叉神經(jīng)節(jié)；DRG背根神經(jīng)節(jié)；GLUT谷氨酸能神經(jīng)元；CHO膽堿能神經(jīng)元；NOR去甲腎上腺素能神經(jīng)元；NBL神經(jīng)母樣細(xì)胞。(F) 模式化NGN2-iN各細(xì)胞簇的代表性標(biāo)志基因熱圖，側(cè)邊欄顯示轉(zhuǎn)移注釋。(G) 第6周模式化NGN2-iN與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的免疫熒光染色，MAP2(上排)和SLC17A6(下排)呈黃色，DAPI呈青色。比例尺：20μm。(H-I) 第10天模式化NGN2-iN的亞型特異性標(biāo)志物特征圖(H)和免疫熒光染色(I)，包括SLC5A7、SLC6A2、NTRK1和TRPM8。比例尺：20μm。

HD-MEA揭示NGN2-iN的功能與形態(tài)多樣性
研究通過(guò)高密度微電極陣列（HD-MEA）技術(shù)系統(tǒng)分析了模式化 NGN2-iN 的電生理和形態(tài)學(xué)特征。

選取6種典型條件進(jìn)行多尺度檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同處理組神經(jīng)元呈現(xiàn)獨(dú)特的動(dòng)作電位模式和放電特性，聚類分析鑒定出11種功能表型。網(wǎng)絡(luò)水平分析顯示形態(tài)發(fā)生素特異性調(diào)控神經(jīng)環(huán)路特性，如CHIR處理組具有可重復(fù)的電生理特征。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)AMPA受體拮抗劑可普遍抑制神經(jīng)活動(dòng)。軸突重建與Sholl分析揭示不同條件誘導(dǎo)的形態(tài)多樣性，且軸突復(fù)雜度與轉(zhuǎn)錄組成熟度高度相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)證明組合模式化不僅能產(chǎn)生功能成熟的神經(jīng)元，還可通過(guò)精確調(diào)控獲得特定電生理和形態(tài)特征，為神經(jīng)回路構(gòu)建和疾病模型研究提供了重要工具。
 

圖2. 模式化NGN2-iN的電生理表征

(A) 星形膠質(zhì)細(xì)胞-NGN2-iN在高密度微電極陣列(HD-MEA)共培養(yǎng)示意圖。HD-MEA可高時(shí)空分辨率表征神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)與軸突形態(tài)。電生理記錄于接種后第14天進(jìn)行(n=66個(gè)培養(yǎng)體系)。(B) 六種模式化條件下單個(gè)神經(jīng)元的動(dòng)作電位序列示例，每條線代表一個(gè)鋒電位。(C) 所有推斷的單細(xì)胞特征UMAP圖(n=14,997個(gè)神經(jīng)元)，按Louvain聚類結(jié)果著色。(D) 各培養(yǎng)體系單細(xì)胞簇組成相似性熱圖，基于(C)中簇身份計(jì)算。(E) 所有單細(xì)胞和網(wǎng)絡(luò)特征的UMAP圖(n=66個(gè)培養(yǎng)體系)，按模式化條件著色。(F) 雷達(dá)圖顯示五個(gè)最重要電生理特征，以對(duì)照組為基準(zhǔn)歸一化。(G) AMPA/紅藻氨酸受體拮抗劑CNQX處理前后單神經(jīng)元放電頻率箱線圖(n=43個(gè)培養(yǎng)體系)。箱體表示中位數(shù)和四分位距，散點(diǎn)為各培養(yǎng)體系平均放電頻率。(H) 基于HD-MEA電信號(hào)重建的98個(gè)神經(jīng)元軸突形態(tài)，展示每組6個(gè)示例。小圓圈示假定胞體/軸突起始段，顏色梯度示動(dòng)作電位傳導(dǎo)方向。(I) Sholl分析兩個(gè)代表性參數(shù)的箱線圖(數(shù)值經(jīng)Z標(biāo)準(zhǔn)化)，散點(diǎn)代表單個(gè)軸突重建結(jié)果。(J) 所有Sholl特征的UMAP圖，著色同(I)。(K) 組合篩選scRNA-seq數(shù)據(jù)中7303個(gè)神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄組成熟度評(píng)分箱線圖。(L) 轉(zhuǎn)錄組成熟度評(píng)分與Sholl特征的散點(diǎn)圖，標(biāo)記點(diǎn)為各條件均值。

形態(tài)發(fā)生素組合激活特異性基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)塑造NGN2-iN神經(jīng)元多樣性
研究系統(tǒng)解析了形態(tài)發(fā)生素組合調(diào)控NGN2-iN多樣性的分子機(jī)制。
通過(guò)分析192種處理?xiàng)l件的單細(xì)胞數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)不同形態(tài)發(fā)生素具有獨(dú)特的調(diào)控特性：RA呈現(xiàn)強(qiáng)劑量依賴性，促進(jìn)后腦膽堿能神經(jīng)元；BMP4主導(dǎo)外周神經(jīng)系統(tǒng)特化；而RA+BMP4等組合表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。機(jī)器學(xué)習(xí)模型揭示RA和CHIR能引發(fā)梯度轉(zhuǎn)錄響應(yīng)，而SHH/FGF8的作用較早飽和。
基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析鑒定出形態(tài)發(fā)生素特異的調(diào)控子（regulon）：RA激活HOXB4/RARB等后腦決定因子，BMP4通過(guò)PHOX2B/MSX1驅(qū)動(dòng)外周神經(jīng)特征，F(xiàn)GF8相關(guān)調(diào)控子偏好中腦命運(yùn)。這些調(diào)控子活性與濃度正相關(guān)，且在不同細(xì)胞系間穩(wěn)定存在。研究首次在單細(xì)胞層面建立了"形態(tài)發(fā)生素組合-調(diào)控網(wǎng)絡(luò)激活-神經(jīng)元命運(yùn)決定"的完整因果關(guān)系，證明組合信號(hào)通過(guò)協(xié)同激活特定轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)神經(jīng)亞型精準(zhǔn)調(diào)控。
 

圖3. 組合形態(tài)發(fā)生素誘導(dǎo)神經(jīng)元多樣性的調(diào)控機(jī)制解析

(A) 各組合條件對(duì)NGN2-iN細(xì)胞簇貢獻(xiàn)的熱圖，細(xì)胞數(shù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化。(B) 點(diǎn)圖顯示形態(tài)發(fā)生素組合引起的細(xì)胞組成與身份變化，點(diǎn)大小表示簇比例，連線示簇連續(xù)性。(C) 各條件生成的細(xì)胞簇?cái)?shù)量。(D) 隨機(jī)森林模型預(yù)測(cè)的形態(tài)發(fā)生素濃度與實(shí)際濃度對(duì)比。(E) 以形態(tài)發(fā)生素信號(hào)調(diào)節(jié)劑為中心的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(GRN)，橢圓節(jié)點(diǎn)為形態(tài)發(fā)生素，圓形節(jié)點(diǎn)為調(diào)控子(轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因)，邊色示關(guān)聯(lián)強(qiáng)度，節(jié)點(diǎn)大小示靶基因數(shù)量。(F) 單細(xì)胞TF敲除(KO)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。(G) 基于組合篩選參考注釋的KO細(xì)胞UMAP圖。(H) 調(diào)控子活性(上)與KO細(xì)胞存在度(下)特征圖，藍(lán)色示KO后減少。(I) 單細(xì)胞TF過(guò)表達(dá)(OE)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。(J) TF-OE數(shù)據(jù)UMAP(上)及其與組合篩選的映射(下)，均按外源TF著色。(K-L) TF-OE細(xì)胞密度(K)與對(duì)應(yīng)調(diào)控子活性(L)特征圖。

模式化NGN2-iN命運(yùn)決定的形態(tài)發(fā)生素-GRN調(diào)控機(jī)制
通過(guò)單細(xì)胞水平的基因編輯和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了形態(tài)發(fā)生素通過(guò)特定轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（GRNs）決定神經(jīng)元亞型的機(jī)制。

敲除實(shí)驗(yàn)顯示，LHX9、MSX1等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的缺失會(huì)特異性消除對(duì)應(yīng)調(diào)控子活躍的神經(jīng)元亞群，如MSX1敲除減少外周神經(jīng)細(xì)胞，HOXB3敲除抑制后腦神經(jīng)元生成。過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)則證明，NGN2與亞型特異性TF（如PHOX2B等）的組合表達(dá)，無(wú)需外源形態(tài)發(fā)生素即可誘導(dǎo)目標(biāo)神經(jīng)元亞型，且純度更高。特別發(fā)現(xiàn)某些TF（如MSX1）的過(guò)表達(dá)效果受時(shí)序調(diào)控影響。這些結(jié)果不僅證實(shí)了形態(tài)發(fā)生素-GRN推斷模型的準(zhǔn)確性，更建立了"核心TF組合決定神經(jīng)元命運(yùn)"的普適性規(guī)律，為神經(jīng)再生醫(yī)學(xué)提供了精準(zhǔn)操控細(xì)胞命運(yùn)的新范式。

預(yù)模式化神經(jīng)祖細(xì)胞狀態(tài)決定NGN2誘導(dǎo)神經(jīng)元的獨(dú)特身份特征
預(yù)模式化指的是在誘導(dǎo)神經(jīng)分化（如表達(dá)NGN2/ASCL1等先驅(qū)轉(zhuǎn)錄因子）之前，先通過(guò)形態(tài)發(fā)生素處理多能干細(xì)胞，使其先分化為具有特定區(qū)域身份的神經(jīng)祖細(xì)胞（NPCs），再進(jìn)行神經(jīng)元誘導(dǎo)。后模式化指的是誘導(dǎo)多能干細(xì)胞直接分化為神經(jīng)元（如通過(guò)NGN2過(guò)表達(dá)），之后再施加形態(tài)發(fā)生素進(jìn)行區(qū)域特化。

研究通過(guò)對(duì)比預(yù)模式化與后模式化策略，揭示了神經(jīng)祖細(xì)胞初始狀態(tài)對(duì)終末神經(jīng)元身份的決定性作用。設(shè)計(jì)96種預(yù)模式化條件結(jié)合單細(xì)胞多組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)不同處理會(huì)塑造神經(jīng)祖細(xì)胞特異的表觀遺傳：前腦祖細(xì)胞富集OTX2結(jié)合位點(diǎn)，后腦祖細(xì)胞則呈現(xiàn)CDX4調(diào)控特征。NGN2作為先鋒因子，通過(guò)開(kāi)啟與神經(jīng)成熟相關(guān)的染色質(zhì)封閉區(qū)域啟動(dòng)分化。關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)包括：（1）預(yù)模式化神經(jīng)元保留祖細(xì)胞的區(qū)域身份，證明NGN2主要執(zhí)行分化而非區(qū)域化功能；（2）RA天然誘導(dǎo)后腦祖細(xì)胞表達(dá)NGN2，揭示內(nèi)源調(diào)控機(jī)制；（3）預(yù)模式化產(chǎn)生更接近體內(nèi)發(fā)育的神經(jīng)元亞型，且異質(zhì)性更低。
 

圖4. 多樣化預(yù)模式化輸入狀態(tài)下的NGN2誘導(dǎo)擴(kuò)展神經(jīng)元多樣性

(A) 預(yù)模式化篩選與NGN2誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。(B) 預(yù)模式化神經(jīng)干/祖細(xì)胞UMAP圖，按注釋著色。(C) 按可及區(qū)域基序富集[NES]著色的UMAP圖。(D) 基序富集與TF表達(dá)相關(guān)性散點(diǎn)圖。(E) NGN2基序可及性差異的ATAC峰示例。(F) NGN2基序可及/不可及關(guān)聯(lián)基因的GO分析。(G-H) 304,912個(gè)預(yù)模式化NGN2-iN細(xì)胞的UMAP圖，按簇身份/形態(tài)發(fā)生素來(lái)源(G)或原代注釋/基礎(chǔ)培養(yǎng)基(H)著色。(I) 預(yù)模式化神經(jīng)干/祖細(xì)胞與NGN2-iN的神經(jīng)身份組成相關(guān)性，每點(diǎn)代表一個(gè)形態(tài)發(fā)生素組合。

預(yù)模式化與后模式化NGN2-iN在細(xì)胞組成、成熟度及調(diào)控子活性上的比較
研究系統(tǒng)比較了預(yù)模式化與后模式化NGN2神經(jīng)元的特征差異。
預(yù)模式化產(chǎn)生更接近體內(nèi)神經(jīng)元的均質(zhì)群體，但成熟較慢且含更多未成熟膠質(zhì)細(xì)胞；后模式化神經(jīng)元成熟更快但異質(zhì)性更高。關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)包括：（1）預(yù)模式化能獲得視網(wǎng)膜前體等特殊亞型；（2）祖細(xì)胞的表觀遺傳記憶延緩但優(yōu)化了分化進(jìn)程；（3）相同形態(tài)發(fā)生素在不同時(shí)序激活差異化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。例如RARB在兩種模式下雖均調(diào)控后腦命運(yùn)，但靶基因譜不同。這些發(fā)現(xiàn)不僅揭示了神經(jīng)分化時(shí)序調(diào)控的重要性，更證明祖細(xì)胞初始狀態(tài)如同"發(fā)育密碼"，持續(xù)影響終末神經(jīng)元的功能特性，為優(yōu)化體外神經(jīng)分化體系提供了重要指導(dǎo)。
 

圖5. 預(yù)模式化與后模式化NGN2-iN的比較

(A) 整合數(shù)據(jù)集489,343個(gè)細(xì)胞的UMAP圖。(B-C) 區(qū)域身份(B)和細(xì)胞類型(C)頻率組成比較。(D) 基于神經(jīng)遞質(zhì)分泌和突觸組裝相關(guān)基因的成熟度比較。(E-F) 異質(zhì)性(E)和原代相似性(F)比較。(G) 預(yù)/后模式化調(diào)控子與RA/BMP4活性的相關(guān)性比較，點(diǎn)大小示調(diào)控子規(guī)模。

轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)結(jié)合組合模式化的普適性細(xì)胞編程策略
通過(guò)將組合模式化策略拓展至ASCL1-DLX2誘導(dǎo)的抑制性神經(jīng)元，建立了普適性細(xì)胞編程體系。

關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)包括：（1）不同先驅(qū)轉(zhuǎn)錄因子（NGN2/ASCL1-DLX2）結(jié)合相同形態(tài)發(fā)生素組合可產(chǎn)生截然不同的神經(jīng)元亞型譜系，證明該策略具有廣泛適用性；（2）預(yù)模式化雖提高細(xì)胞純度但伴隨更多脫靶細(xì)胞，揭示DLX2等多效性因子的譜系限制作用；（3）構(gòu)建的整合神經(jīng)元圖譜包含185個(gè)分子特征明確的亞群，最高純度達(dá)84%，為神經(jīng)科學(xué)研究提供豐富資源；（4）發(fā)現(xiàn)形態(tài)發(fā)生素濃度與神經(jīng)肽表達(dá)的定量關(guān)系（如CHIR-NPY、BMP4-生長(zhǎng)抑素），為疾病模型構(gòu)建提供調(diào)控靶點(diǎn)；（5）系統(tǒng)比較顯示模式化iNs能準(zhǔn)確模擬原代神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)和電生理特征，但在能量代謝方面存在顯著差異，提示體外體系仍需優(yōu)化。這些發(fā)現(xiàn)不僅證實(shí)了"轉(zhuǎn)錄因子+形態(tài)發(fā)生素"組合策略在神經(jīng)分化中的普適性，更通過(guò)建立表型-條件-調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的定量關(guān)系，為再生醫(yī)學(xué)和疾病建模提供了標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞編程框架。特別值得注意的是，研究揭示了體外培養(yǎng)環(huán)境對(duì)細(xì)胞代謝的重編程效應(yīng)，這為改進(jìn)神經(jīng)元成熟度提供了重要方向。
 

圖6. 組合模式化產(chǎn)生多樣化GABA能ASCL1/DLX2-iN

(A) ASCL1/DLX2誘導(dǎo)的預(yù)/后模式化篩選設(shè)計(jì)。(B) ASCL1/DLX2-iN的UMAP圖。(C) 430,936個(gè)神經(jīng)細(xì)胞的整合圖譜UMAP。(D) 形態(tài)發(fā)生素濃度與轉(zhuǎn)錄差異的散點(diǎn)圖。(E) 基于轉(zhuǎn)錄組距離的聚類樹(shù)狀圖，熱圖示各簇最佳條件的濃度，條形圖示簇純度。(F) NGN2與ASCL1/DLX2-iN調(diào)控子與BMP4/RA相關(guān)性比較。(G) 形態(tài)發(fā)生素對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)/神經(jīng)肽基因表達(dá)的隨機(jī)森林預(yù)測(cè)重要性熱圖。(H) 神經(jīng)遞質(zhì)/神經(jīng)肽表達(dá)與形態(tài)發(fā)生素濃度的箱線圖。

研究總結(jié)
這篇研究通過(guò)系統(tǒng)篩選480種形態(tài)發(fā)生素組合，結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序、高密度微電極陣列（HD-MEA）等技術(shù)，在人類干細(xì)胞中建立了定向誘導(dǎo)多樣化神經(jīng)元亞型的普適性策略。
研究發(fā)現(xiàn)預(yù)模式化（先區(qū)域化后分化）能產(chǎn)生更接近體內(nèi)神經(jīng)元的亞型，而后模式化（先分化后區(qū)域化）則更快速高效。通過(guò)解析形態(tài)發(fā)生素-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，研究不僅揭示了神經(jīng)元命運(yùn)決定的協(xié)同信號(hào)機(jī)制，還構(gòu)建了包含400余種亞型的神經(jīng)元圖譜。該成果為神經(jīng)系統(tǒng)疾病建模、藥物篩選和細(xì)胞治療提供了重要工具和理論框架，是干細(xì)胞神經(jīng)定向分化領(lǐng)域的重大突破。

參考文獻(xiàn)：
Lin HC, Janssens J, Eisinger B, et al. Human neuron subtype programming via single-cell transcriptome-coupled patterning screens. Science. 2025 Jul 10;389(6756):eadn6121. doi: 10.1126/science.adn6121. 

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