當(dāng)前位置 > 首頁(yè) > 技術(shù)文章 > Pipetty電動(dòng)移液器在基孔肯雅病毒核酸檢測(cè)（實(shí)時(shí)熒光-PCR）中的應(yīng)用

選型 | 市場(chǎng) | 應(yīng)用 | 使用 | 法規(guī) | 技術(shù) | 其他

Pipetty電動(dòng)移液器在基孔肯雅病毒核酸檢測(cè)（實(shí)時(shí)熒光-PCR）中的應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：228　發(fā)布日期：2025-7-21　來源：程淇生物

Pipetty電動(dòng)移液器在基孔肯雅病毒核酸檢測(cè)（實(shí)時(shí)熒光-PCR）中的應(yīng)用

方案摘要：

本方案聚焦 Pipetty 電動(dòng)移液器在基孔肯雅病毒核酸實(shí)時(shí)熒光 - PCR 檢測(cè)中的應(yīng)用。該移液器憑借高精度、自動(dòng)化及防污染設(shè)計(jì)，在檢測(cè)各環(huán)節(jié)發(fā)揮關(guān)鍵作用。在樣本前處理與 RNA 提取階段，微量分液功能提高 RNA 洗脫回收率；PCR 體系配制時(shí)，連續(xù)分液模式快速分配試劑，防污染吸頭避免氣溶膠污染；質(zhì)量控制中，精準(zhǔn)移取對(duì)照品保證結(jié)果可靠。同時(shí)，其具備溫度補(bǔ)償功能、能減少人為誤差，提升效率與準(zhǔn)確性，且維護(hù)成本低、合規(guī)性強(qiáng)，為檢測(cè)提供有力支持，保障結(jié)果的精準(zhǔn)與可重復(fù)。

方案詳情：

一、實(shí)驗(yàn)原理

病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下產(chǎn)生cDNA，可作為聚合酶鏈(PCR)擴(kuò)增反應(yīng)的模版。TagMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR時(shí),在反應(yīng)體系中加入一對(duì)病毒特異性引物和一條熒光基團(tuán)標(biāo)記的病毒特異性探針。Tagllan探針的兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán),在探針完好的情況下,報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)所吸收，因而檢測(cè)不到熒光信號(hào)。

在PCR擴(kuò)增過程中，探針和引物與目標(biāo)序列結(jié)合，當(dāng)新生鏈沿著cDNA模板延伸到熒光標(biāo)記的探針結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，Tag酶發(fā)揮5'一3’核酸外切酶的功能，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，熒光基團(tuán)釋放熒光信號(hào)。這樣模板每擴(kuò)增一次，就產(chǎn)生一個(gè)游離的熒光分子，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板可進(jìn)行定量分析。其中RNA逆轉(zhuǎn)錄過程可以和PCR擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行也可先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其他類似機(jī)制的熒光探針也可用于核酸檢測(cè)。

二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1、設(shè)配和材料

① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-250及配套吸頭;
② 離心管(1.5 mL、0.2 mL 和 0.1 mL);
③ 試管架(5 mL、1.5 mL和 20μL );
④ 高速冷凍離心機(jī);
⑤ 旋渦混合器;
⑥ 熒光定量 PCR 儀等;

2，試劑和材料

① 病毒核酸提取試劑盒;
② 熒光定量 RT-PCR試劑盒;
③ 引物及探針等(參考序列下):
CHIKV-FP：5’-TTTAGCCGTAATGAGCRTCGG-3'
CHIKV-RP：5’-CCGTGTTCGGGATCACTGTTA-3’
CHIKV-P：5’-FAMTGCCCACACTGTGA-BHQ1-3’(帶下劃線的堿基需要 LNA 修飾)。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1、病毒 RNA 提取：待檢標(biāo)本用病毒 RNA 提取試劑盒提取，操作步驟按說明書進(jìn)行，制備的病毒核酸作為 Real-time RT-PCR的模板。
2、配置反應(yīng)體系

2×RT-PCR 混合液	10	含酶、dNTPs 等基礎(chǔ)反應(yīng)成分
上游引物（10μM）	0.8	特異性結(jié)合 CHIKV cDNA 正義鏈
下游引物（10μM）	0.8	特異性結(jié)合 CHIKV cDNA 反義鏈
熒光探針（10μM）	0.4	結(jié)合靶序列，擴(kuò)增時(shí)釋放熒光信號(hào)
模板 RNA	5	待檢測(cè)的病毒 RNA（可根據(jù)濃度調(diào)整）
無 RNA 酶水	3	補(bǔ)足體系至 20μL

根據(jù)試驗(yàn)要求設(shè)置陰性、陽(yáng)性、內(nèi)參對(duì)照。
根據(jù)需要檢測(cè)的樣品數(shù)量，配制反應(yīng)體系，將混合液、引物、探針、水充分混勻后分裝，使用Pipetty電動(dòng)移液器的連續(xù)分液模式，設(shè)置每次分液量和連續(xù)分液次數(shù)，每管分液15μL，轉(zhuǎn)移反應(yīng)管至樣品制備區(qū)。

5、自動(dòng)更換吸頭，設(shè)置分液量和分液次數(shù)，吸取RNA溶液，在反應(yīng)管中分別加入5μL RNA ，使每管總體積達(dá)到 20μL，記錄反應(yīng)管對(duì)應(yīng)的樣品編號(hào)。應(yīng)注意操作過程中，每次操作都更換新的滅菌吸頭，嚴(yán)防不同樣品間的交叉污染。反應(yīng)液分裝時(shí)避免產(chǎn)生氣泡，上機(jī)前檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄漏污染儀器。
6、Real-time RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增：一步法Real-time RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)條件為: 42℃ 15 min，95℃ 2min，95℃ 10 s，62℃ 30 s，45 個(gè)循環(huán)，儀器設(shè)置在每一循環(huán) 62℃退火/延伸步驟讀取熒光信號(hào)。該反應(yīng)條件可根據(jù)采用的試劑要求進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

四、試驗(yàn)結(jié)果

1、以熒光 PCR 反應(yīng)的前 3~15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，以本底信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的 10 倍作為熒光閾值，標(biāo)本擴(kuò)增產(chǎn)生的熒光信號(hào)達(dá)到熒光閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)為循環(huán)閾值(Ct 值)。
2、檢測(cè)樣品的 Ct 值≤35.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，可報(bào)告樣品特異性核酸檢測(cè)陽(yáng)性。檢測(cè)樣品的 Ct 值介于 35~45 之間時(shí)，屬臨界區(qū)間，建議重復(fù)檢測(cè)。若重復(fù)檢測(cè)結(jié)果 Ct 值≥45.0者為陰性；若 Ct值仍介于 35~45 之間，且擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)特征者，可報(bào)告樣品特異性核酸檢測(cè)陽(yáng)性。
3、陽(yáng)性對(duì)照的 Ct 值應(yīng)≤32.0，并出現(xiàn)典型的“S”型擴(kuò)增曲線；陰性對(duì)照 Ct 值應(yīng)≥45；否則視為實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效，需重復(fù)檢測(cè)。

索取資料

發(fā)布者：廣州市程淇生物技術(shù)有限公司
聯(lián)系電話：020-87228031 020-87228316
E-mail：info@icfbio.com

【點(diǎn)擊可查看廣州市程淇生物技術(shù)有限公司相關(guān)產(chǎn)品】

標(biāo)簽：基孔肯雅pcr 電動(dòng)移液器微量液體轉(zhuǎn)移

分享到：QQ空間新浪微博騰訊微博微信

【所有文章】【本類新聞】【相關(guān)產(chǎn)品】【關(guān)閉窗口】

本類文章

本類新聞

感谢您访问我们的网站，您可能还对以下资源感兴趣：

亚洲成av人片在现

99这里只精品热在线获取成a人v欧美综合天堂久久久久久久久久久久久久高潮无码无码精品一区二区福利视频