Pipetty電動(dòng)移液器在登革熱病毒檢測（酶聯(lián)免疫法）中的應(yīng)用

方案摘要：本方案采用雙抗體夾心法檢測登革病毒 NS1 抗原，適用于發(fā)病 5 天內(nèi)患者血清的早期診斷。以抗 NS1 單克隆抗體包被酶標(biāo)板，結(jié)合待檢血清中 NS1 抗原后，加入酶標(biāo)記抗體形成復(fù)合物，經(jīng)顯色反應(yīng)判讀結(jié)果。操作中使用 Pipetty 電動(dòng)移液器精準(zhǔn)移取試劑，關(guān)鍵步驟包括包被、加樣、酶標(biāo)反應(yīng)、顯色及終止。結(jié)果以臨界值判定陰陽性，顯色強(qiáng)度與抗原含量正相關(guān)。該方法通過標(biāo)準(zhǔn)化操作提升檢測準(zhǔn)確性，可快速為登革熱早期診斷、疫情監(jiān)測提供依據(jù)，注意避免標(biāo)本污染及與 Zika 病毒的交叉反應(yīng)干擾。
  
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
      在微孔條上預(yù)包被登革病毒的單克隆抗體，該抗體可與登革熱病例血清中的登革病毒中的NS1抗原特異性結(jié)合，再與辣根過氧化酶標(biāo)記抗NS1抗體試劑進(jìn)行第二次溫育，當(dāng)樣品中存在登革病毒NS1抗原時(shí)將形成“包被抗體-NS1-酶標(biāo)抗體”復(fù)合物。加入顯色劑，復(fù)合物上連接的辣根過氧化物酶催化顯示劑反應(yīng)，生成藍(lán)色產(chǎn)物，終止反應(yīng)后，變?yōu)辄S色，若樣品中無登革病毒NS1抗原則不顯示。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸頭。
② 洗板機(jī)。
③ 酶標(biāo)儀。
④ 恒溫溫箱。
⑤ 10mL吸管。
⑥ 稀釋血清用的試管。
⑦ 吸水紙。
 
2、試劑和材料
① 登革病毒NS1抗原酶聯(lián)免疫診斷試劑盒。
② 蒸餾水或去離子水。
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、將試劑盒在冰箱中取出，放置室溫平衡 30min，使用前將試劑輕輕振蕩混勻；
2、配液：將試劑盒中濃縮洗滌液用蒸餾水 20倍稀釋；
3、編號：將樣品對應(yīng)微孔板編號，每板設(shè)陰性對照3孔，陽性對照2孔和空白對照1孔；
4、加稀釋液：使用Pipetty電動(dòng)移液器，設(shè)置連續(xù)分液模式，每孔加稀釋液 50uL，空白孔除外；
5、加樣：更換新吸頭，使用連續(xù)分液模式分別在相應(yīng)孔加入待測樣品或陰陽性對照各 50uL，空白孔除外；
 
6、溫育：用封板膜封板后，置 37℃溫育 60min；
7、每孔加酶標(biāo)試劑 50uL，空白孔除外，輕輕振蕩混勻；
8、溫育：用封板膜封板后，置 37℃溫育 30min；
9、洗板：小心揭掉封板膜，用洗板機(jī)洗滌5遍，最后1次盡量扣干；
10、顯色：每孔加入顯色劑A、B液各 50uL，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色 15min；
11、測定：每孔加終止液 50uL，10min 內(nèi)測定結(jié)果。設(shè)定酶標(biāo)儀波長于 450nm 處[建議使用雙波長 450nm/(600~650)nm 檢測]，用空白孔調(diào)零后測定各孔A值。
 
四、試驗(yàn)結(jié)果
臨界值計(jì)算：臨界值=0.10+陰性對照孔A值均值（陰性對照孔A值低于0.05者以0.05計(jì)算）。
陰性對照的正常值范圍：陰性對照孔A≤0.1(若1孔A>0.1應(yīng)舍棄，若兩孔或兩孔以上陰性對照>0.1，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn))。
陽性對照正常值范圍：A≥0.8。
陽性判定：樣品A值多臨界值者為登革病毒抗原陽性。
陰性判定：樣品A值<臨界值者為登革病毒抗原陰性。