Int J Biol Macromol：DAP-seq助力揭示水稻抗病新機制
研究背景
水稻在生長過程中會遭受多種生物脅迫，其中稻瘟病、細菌性葉枯病和紋枯病是最具破壞性的三大病害，會造成全球范圍內(nèi)的糧食減產(chǎn)。植物激素如茉莉酸（JA）等可介導(dǎo)復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)以激活水稻的免疫反應(yīng)。MYC轉(zhuǎn)錄因子是JA信號的主要調(diào)節(jié)因子，而泛素化作為重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在植物免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此前研究發(fā)現(xiàn)水稻RING型E3泛素連接酶OsBBI1可正向調(diào)控水稻對稻瘟病的抗性，但其作用機制尚不明確。
文獻解讀
2025年6月，浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所宋鳳鳴團隊在《International Journal of Biological Macromolecules》發(fā)表了題為“Rice E3 ubiquitin ligase BLAST AND BTH-INDUCED 1 targets jasmonic acid signaling co-repressors to release Myelocytomatosis protein 2 for modulating immune responses against blast fungus”的研究論文。本研究借助DAP-seq技術(shù)，深入探索了OsBBI1調(diào)控水稻免疫的分子網(wǎng)絡(luò)，揭示了其通過降解JA信號抑制因子、釋放關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的完整抗病通路。
水稻在生長過程中會遭受多種生物脅迫，其中稻瘟病、細菌性葉枯病和紋枯病是最具破壞性的三大病害，會造成全球范圍內(nèi)的糧食減產(chǎn)。植物激素如茉莉酸（JA）等可介導(dǎo)復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)以激活水稻的免疫反應(yīng)。MYC轉(zhuǎn)錄因子是JA信號的主要調(diào)節(jié)因子，而泛素化作為重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在植物免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此前研究發(fā)現(xiàn)水稻RING型E3泛素連接酶OsBBI1可正向調(diào)控水稻對稻瘟病的抗性，但其作用機制尚不明確。
文獻解讀
2025年6月，浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所宋鳳鳴團隊在《International Journal of Biological Macromolecules》發(fā)表了題為“Rice E3 ubiquitin ligase BLAST AND BTH-INDUCED 1 targets jasmonic acid signaling co-repressors to release Myelocytomatosis protein 2 for modulating immune responses against blast fungus”的研究論文。本研究借助DAP-seq技術(shù)，深入探索了OsBBI1調(diào)控水稻免疫的分子網(wǎng)絡(luò)，揭示了其通過降解JA信號抑制因子、釋放關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的完整抗病通路。
技術(shù)路線
研究結(jié)果
研究團隊通過酵母雙雜交（Y2H）、雙熒光素酶互補（BiFC）、免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down、熒光素酶互補（LCI）等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)OsBBI1能直接結(jié)合JA信號通路中的抑制蛋白OsJAZ6、OsJAZ7、OsJAZ8及OsNINJA1。體外泛素化實驗、幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的ROS爆發(fā)實驗和細胞降解實驗進一步證實，OsBBI1通過其RING結(jié)構(gòu)域催化這些蛋白的泛素化修飾，并促使它們通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）降解。證實OsBBI1通過降解JA信號的抑制蛋白（OsJAZs和OsNINJA1），解除其對免疫反應(yīng)的抑制。當?shù)疚敛【肭謺r，OsBBI1能快速清除這些抑制因子，激活免疫反應(yīng)。
研究團隊通過酵母雙雜交（Y2H）、雙熒光素酶互補（BiFC）、免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down、熒光素酶互補（LCI）等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)OsBBI1能直接結(jié)合JA信號通路中的抑制蛋白OsJAZ6、OsJAZ7、OsJAZ8及OsNINJA1。體外泛素化實驗、幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的ROS爆發(fā)實驗和細胞降解實驗進一步證實，OsBBI1通過其RING結(jié)構(gòu)域催化這些蛋白的泛素化修飾，并促使它們通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）降解。證實OsBBI1通過降解JA信號的抑制蛋白（OsJAZs和OsNINJA1），解除其對免疫反應(yīng)的抑制。當?shù)疚敛【肭謺r，OsBBI1能快速清除這些抑制因子，激活免疫反應(yīng)。
圖1. OsBBI1與OsJAZ6、OsJAZ7和OsJAZ8相互作用并使其泛素化。
圖2. OsBBI1介導(dǎo)OsJAZ6和OsJAZ7的降解。
圖3. OsJAZ6、OsJAZ7和OsJAZ8負調(diào)控水稻稻瘟病抗性及幾丁質(zhì)觸發(fā)的免疫反應(yīng)。
圖4. OsBBI1和OsJAZ6與OsNINJA1相互作用，且OsBBI1抑制OsJAZ6和OsNINJA1的負向免疫功能。
通過BiFC、GST pull down和亞細胞定位分析，證實OsJAZ6與OsMYC2、OsMYC3相互作用，且OsMYC2與OsMYC3可形成同型/異型二聚體，主要分布于細胞核中。利用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建OsMYC2過表達株系和Osmyc3敲除突變體，結(jié)合稻瘟病菌接種實驗、RT-qPCR和DAB染色，發(fā)現(xiàn)過表達植株的病斑更少、更小，真菌生長也更少，相應(yīng)的OsPBZ1和OsJAmyb的表達顯著上調(diào)，H₂O₂積累增強；而突變體株系則相反。這些結(jié)果表明，OsMYC2和OsMYC3通過促進病原體誘導(dǎo)的防御基因表達和活性氧（ROS）積累，正向調(diào)控水稻對稻瘟病菌的免疫反應(yīng)。
圖5. OsBBI1、OsJAZ6和OsNINJA1與OsTPL、OsTPR2、OsMYC2及OsMYC3存在相互作用。
圖6. OsMYC2和OsMYC3對水稻稻瘟病抗性起正向調(diào)控作用。
為了進一步研究OsMYC2的調(diào)控機制，本研究利用DAP-seq技術(shù)分析了OsMYC2在全基因組的結(jié)合位點。在兩個獨立的生物學(xué)重復(fù)中分別獲得了5776個和3281個假定結(jié)合峰，其中2038個為重疊結(jié)合峰。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，30.3%的結(jié)合峰富集于基因啟動子區(qū)域，表明OsMYC2主要通過調(diào)控啟動子區(qū)域基因表達發(fā)揮功能。結(jié)合峰在水稻各染色體上呈非偏倚性分布，涉及1084個基因的啟動子，KEGG富集分析顯示，其顯著富集于次生代謝物生物合成、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK信號通路。結(jié)合ChIP-PCR、EMSA和熒光素酶報告基因?qū)嶒灒?/strong>證實OsMYC2可通過結(jié)合OsGST、OsOXO3、OsOXO4、OsZIP9等防御基因啟動子中的G-box元件，直接調(diào)控其轉(zhuǎn)錄表達。結(jié)果表明OsMYC2是連接OsBBI1與下游免疫反應(yīng)的核心樞紐。當OsJAZs被降解后，OsMYC2進入細胞核，與OsMYC3聯(lián)手啟動抗氧化酶、金屬轉(zhuǎn)運蛋白等基因的表達，增強水稻對病菌的抵抗能力。
圖7. OsMYC2通過結(jié)合啟動子中的G-box元件調(diào)控OsGST、OsOXO3、OsOXO4和OsZIP9的表達。
該研究突破了傳統(tǒng)對JA信號調(diào)控的認知，構(gòu)建了“OsBBI1→降解JA抑制因子→釋放OsMYC2→激活防御基因”的完整調(diào)控鏈，證實E3泛素連接酶可通過“降解抑制因子”的方式快速激活免疫，為作物抗病機制研究提供了新思路。
圖 8. OsMYC2激活OsOXO4和OsZIP9的轉(zhuǎn)錄，并提出OsBBI1-OsJAZ6-OsMYC2模塊在水稻免疫中功能的工作模型。
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