ATAC-seq技術原理及在植物器官發(fā)育中的應用
什么是ATAC-seq？
染色質開放性測序（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing，ATAC-seq），一種用于檢測染色質開放性的高通量測序技術，通過Tn5轉座酶切割并標記開放的染色質區(qū)域，從而揭示基因組中調控元件（如增強子、啟動子）的位置和活性。
技術原理
在真核生物中，DNA并不是裸露存在的，而是與組蛋白等結合形成染色質。染色質的結構狀態(tài)會影響基因的表達，那些處于開放狀態(tài)的染色質區(qū)域，更容易與轉錄因子等蛋白結合，進而啟動基因的轉錄過程。ATAC-seq利用Tn5轉座酶識別并切割染色質中開放區(qū)域的DNA，切割后的DNA片段直接用于文庫構建和測序。測序結果通過生物信息學分析，可以確定基因組中開放染色質區(qū)域的位置和特征。
染色質開放性測序（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing，ATAC-seq），一種用于檢測染色質開放性的高通量測序技術，通過Tn5轉座酶切割并標記開放的染色質區(qū)域，從而揭示基因組中調控元件（如增強子、啟動子）的位置和活性。
技術原理
在真核生物中，DNA并不是裸露存在的，而是與組蛋白等結合形成染色質。染色質的結構狀態(tài)會影響基因的表達，那些處于開放狀態(tài)的染色質區(qū)域，更容易與轉錄因子等蛋白結合，進而啟動基因的轉錄過程。ATAC-seq利用Tn5轉座酶識別并切割染色質中開放區(qū)域的DNA，切割后的DNA片段直接用于文庫構建和測序。測序結果通過生物信息學分析，可以確定基因組中開放染色質區(qū)域的位置和特征。
植物的生長發(fā)育是一個高度復雜且精密調控的過程，從種子萌發(fā)到器官形成，從開花結果到衰老凋亡，每一個階段都涉及海量基因的時空特異性表達。而這些基因的表達模式，很大程度上受到染色質結構狀態(tài)的調控——開放的染色質區(qū)域為轉錄因子等調控蛋白提供了結合位點，進而啟動或抑制基因轉錄，最終影響器官的形態(tài)建成與功能實現。
ATAC-seq憑借其對染色質開放區(qū)域的精準捕捉能力，打破了傳統(tǒng)研究中僅依賴基因表達數據推測調控機制的局限。它像一把“分子鑰匙”，能夠直接解鎖基因組中那些隱藏的調控密碼：通過定位不同發(fā)育階段、不同組織器官中的開放染色質區(qū)域（ACRs），研究者可以直觀地觀察到調控元件（如啟動子、增強子）的活性變化，進而關聯(lián)其與下游靶基因的表達聯(lián)動關系。這種從“結構動態(tài)”到“功能效應”的研究思路，為揭示植物器官發(fā)育的深層調控網絡提供了強有力的技術支撐。
在植物研究領域，ATAC-seq技術為解析器官發(fā)育的分子調控機制提供了全新視角。以下通過具體案例，進一步展示ATAC-seq在解析植物器官發(fā)育分子機制中的實際應用。
ATAC-seq在植物器官發(fā)育研究中的應用案例
案例1：ATAC-seq在蘋果果實發(fā)育中糖酸積累調控機制研究中的應用
ATAC-seq憑借其對染色質開放區(qū)域的精準捕捉能力，打破了傳統(tǒng)研究中僅依賴基因表達數據推測調控機制的局限。它像一把“分子鑰匙”，能夠直接解鎖基因組中那些隱藏的調控密碼：通過定位不同發(fā)育階段、不同組織器官中的開放染色質區(qū)域（ACRs），研究者可以直觀地觀察到調控元件（如啟動子、增強子）的活性變化，進而關聯(lián)其與下游靶基因的表達聯(lián)動關系。這種從“結構動態(tài)”到“功能效應”的研究思路，為揭示植物器官發(fā)育的深層調控網絡提供了強有力的技術支撐。
在植物研究領域，ATAC-seq技術為解析器官發(fā)育的分子調控機制提供了全新視角。以下通過具體案例，進一步展示ATAC-seq在解析植物器官發(fā)育分子機制中的實際應用。
ATAC-seq在植物器官發(fā)育研究中的應用案例
案例1：ATAC-seq在蘋果果實發(fā)育中糖酸積累調控機制研究中的應用
文章標題：Transcriptional landscape and dynamics involved in sugar and acid accumulation during apple fruit development
研究背景：
蘋果是溫帶重要果樹，果實品質（如風味）主要由可溶性糖和有機酸決定。盡管已知果實發(fā)育中糖酸動態(tài)變化（早期有機酸積累、后期淀粉降解為糖），但轉錄水平調控其積累的分子機制仍不明確。染色質可及性影響基因轉錄，而蘋果果實發(fā)育中染色質可及性景觀尚未闡明。
研究思路：
研究背景：
蘋果是溫帶重要果樹，果實品質（如風味）主要由可溶性糖和有機酸決定。盡管已知果實發(fā)育中糖酸動態(tài)變化（早期有機酸積累、后期淀粉降解為糖），但轉錄水平調控其積累的分子機制仍不明確。染色質可及性影響基因轉錄，而蘋果果實發(fā)育中染色質可及性景觀尚未闡明。
研究思路：
關鍵結果：
該研究通過ATAC-seq分析蘋果成熟葉片及果實3個關鍵發(fā)育階段，揭示染色質可及性的組織與發(fā)育特異性：葉片染色質開放區(qū)域（ACRs）約為果實的1.5倍，果實ACRs隨成熟逐漸增加，且主要分布于啟動子-轉錄起始位點區(qū)域。比較不同階段發(fā)現，差異可及區(qū)域（DARs）變化幅度大于差異表達基因，整合后篩選出啟動子可及性和表達量均增加的基因（PEIGs），富集于轉錄調控、碳水化合物代謝等通路。對DARs區(qū)域進行motif分析，發(fā)現362個果實富集motif，含29個果實特異性motif，涉及Dof、AP2/ERF等家族轉錄因子，其中5個Dof家族基因經驗證可結合糖酸代謝相關基因啟動子并調控其表達。同時證實糖酸代謝關鍵基因啟動子區(qū)域可及性隨成熟增加，與基因表達上調一致，受染色質開放狀態(tài)及Dof家族轉錄因子協(xié)同調控。
該研究通過ATAC-seq分析蘋果成熟葉片及果實3個關鍵發(fā)育階段，揭示染色質可及性的組織與發(fā)育特異性：葉片染色質開放區(qū)域（ACRs）約為果實的1.5倍，果實ACRs隨成熟逐漸增加，且主要分布于啟動子-轉錄起始位點區(qū)域。比較不同階段發(fā)現，差異可及區(qū)域（DARs）變化幅度大于差異表達基因，整合后篩選出啟動子可及性和表達量均增加的基因（PEIGs），富集于轉錄調控、碳水化合物代謝等通路。對DARs區(qū)域進行motif分析，發(fā)現362個果實富集motif，含29個果實特異性motif，涉及Dof、AP2/ERF等家族轉錄因子，其中5個Dof家族基因經驗證可結合糖酸代謝相關基因啟動子并調控其表達。同時證實糖酸代謝關鍵基因啟動子區(qū)域可及性隨成熟增加，與基因表達上調一致，受染色質開放狀態(tài)及Dof家族轉錄因子協(xié)同調控。
圖1. 蘋果葉片和果實發(fā)育階段12個文庫的ATAC-seq分析。
圖2. 蘋果果實3個發(fā)育階段ATAC-seq與RNA-seq的關聯(lián)分析。
圖3. 蘋果果實中糖和酸代謝相關基序的分析。
圖2. 蘋果果實3個發(fā)育階段ATAC-seq與RNA-seq的關聯(lián)分析。
圖3. 蘋果果實中糖和酸代謝相關基序的分析。
圖4. 驗證所選果實特異性轉錄因子與其候選靶基因在糖或酸積累中的相互作用。
案例2：ATAC-seq在葫蘆科作物早期果實發(fā)育相關保守順式調控元件研究中的應用
文章標題：Identification and functional characterization of conserved cis-regulatory elements responsible for early fruit development in cucurbit crops
研究背景：
順式調控元件（CREs）通過調控基因表達影響表型，是作物改良的重要靶點。葫蘆科作物（如黃瓜、西瓜等）從下位子房發(fā)育成果實，早期果實發(fā)育存在相似生物學過程（如細胞分裂向擴張的轉變），但相關保守CREs尚未明確。
研究思路：
研究背景：
順式調控元件（CREs）通過調控基因表達影響表型，是作物改良的重要靶點。葫蘆科作物（如黃瓜、西瓜等）從下位子房發(fā)育成果實，早期果實發(fā)育存在相似生物學過程（如細胞分裂向擴張的轉變），但相關保守CREs尚未明確。
研究思路：
關鍵結果：
該研究聚焦葫蘆科作物早期果實，探究CREs在葫蘆科早期果實發(fā)育中的作用、進化約束及特有CREs的存在。通過比較基因組學在6種葫蘆科作物及5種外類群物種中鑒定出392,438個保守非編碼序列（CNSs），其中82,756個為葫蘆科特有。同時，通過ATAC-seq和RNA-seq聯(lián)合分析，在6種葫蘆科作物果實的2個組織、2個關鍵發(fā)育階段（細胞分裂期和擴張期）定位了20,865至43,204個可及染色質區(qū)域（ACRs），這些區(qū)域與基因表達水平正相關，且存在組織和階段特異性。通過整合分析，研究發(fā)現4,431個共線同源CNSs在6種作物中均與ACRs重疊，其中1,687個為葫蘆科特有，推測這些序列通過調控757個相鄰同源基因參與早期果實發(fā)育，并受強進化約束。CRISPR突變實驗進一步驗證，靶向NAC1和EXT-like基因附近的葫蘆科特有CNSs后，基因表達模式顯著改變，果實形狀和細胞尺寸也發(fā)生明顯變化，直接證明了這些CNSs的調控功能。綜上，該研究不僅為葫蘆科作物遺傳改良提供了關鍵靶點，還揭示了CREs在植物發(fā)育和進化中的重要性，為深入理解保守調控元件的功能及機制奠定了基礎。
該研究聚焦葫蘆科作物早期果實，探究CREs在葫蘆科早期果實發(fā)育中的作用、進化約束及特有CREs的存在。通過比較基因組學在6種葫蘆科作物及5種外類群物種中鑒定出392,438個保守非編碼序列（CNSs），其中82,756個為葫蘆科特有。同時，通過ATAC-seq和RNA-seq聯(lián)合分析，在6種葫蘆科作物果實的2個組織、2個關鍵發(fā)育階段（細胞分裂期和擴張期）定位了20,865至43,204個可及染色質區(qū)域（ACRs），這些區(qū)域與基因表達水平正相關，且存在組織和階段特異性。通過整合分析，研究發(fā)現4,431個共線同源CNSs在6種作物中均與ACRs重疊，其中1,687個為葫蘆科特有，推測這些序列通過調控757個相鄰同源基因參與早期果實發(fā)育，并受強進化約束。CRISPR突變實驗進一步驗證，靶向NAC1和EXT-like基因附近的葫蘆科特有CNSs后，基因表達模式顯著改變，果實形狀和細胞尺寸也發(fā)生明顯變化，直接證明了這些CNSs的調控功能。綜上，該研究不僅為葫蘆科作物遺傳改良提供了關鍵靶點，還揭示了CREs在植物發(fā)育和進化中的重要性，為深入理解保守調控元件的功能及機制奠定了基礎。
圖1. 六種葫蘆科作物中兩個關鍵階段的兩種組織ACRs的鑒定與表征。
圖2. 六種葫蘆科作物中ACR的保守性。
圖3. 與六種葫蘆科植物中ACR重疊的1,687個葫蘆科特異性CNS潛在靶基因特征分析。
圖2. 六種葫蘆科作物中ACR的保守性。
圖3. 與六種葫蘆科植物中ACR重疊的1,687個葫蘆科特異性CNS潛在靶基因特征分析。
案例3：ATAC-seq在玉米葉片發(fā)育過程中染色質可及性研究中的應用
文章標題：Dynamic Chromatin Accessibility and Gene Expression Regulation During Maize Leaf Development
研究背景：
玉米是重要的糧食作物和模式生物，葉片作為光合作用主要器官，其發(fā)育直接影響產量；染色質可及性與基因轉錄調控密切相關，但在玉米葉片不同發(fā)育階段的具體作用尚不明確。
研究思路：
研究背景：
玉米是重要的糧食作物和模式生物，葉片作為光合作用主要器官，其發(fā)育直接影響產量；染色質可及性與基因轉錄調控密切相關，但在玉米葉片不同發(fā)育階段的具體作用尚不明確。
研究思路：
關鍵結果：
本研究旨在探究玉米葉片BBCH_11、BBCH_13、BBCH_17三個發(fā)育階段中染色質可及性的動態(tài)變化及其對全基因組基因表達的影響，通過ATAC-seq（檢測染色質可及性）和RNA-seq（分析基因表達）的整合分析，發(fā)現三個階段分別鑒定出46,808、38,242、41,084個可及染色質區(qū)域（ACRs），且ACR的數量和強度顯著影響基因表達水平；同時識別出與葉片發(fā)育相關的關鍵轉錄因子和潛在轉錄抑制因子，揭示了染色質可及性通過調控轉錄因子結合，在玉米葉片時空基因表達調控中起關鍵作用。
本研究旨在探究玉米葉片BBCH_11、BBCH_13、BBCH_17三個發(fā)育階段中染色質可及性的動態(tài)變化及其對全基因組基因表達的影響，通過ATAC-seq（檢測染色質可及性）和RNA-seq（分析基因表達）的整合分析，發(fā)現三個階段分別鑒定出46,808、38,242、41,084個可及染色質區(qū)域（ACRs），且ACR的數量和強度顯著影響基因表達水平；同時識別出與葉片發(fā)育相關的關鍵轉錄因子和潛在轉錄抑制因子，揭示了染色質可及性通過調控轉錄因子結合，在玉米葉片時空基因表達調控中起關鍵作用。
圖1. 實驗裝置和ATAC-seq質量評估。
圖2. 與ACRs相關的基因表達水平。
圖3. ACR在葉片發(fā)育過程中呈現動態(tài)變化。
圖4. 階段特異性ACR相關基因的功能分析。
圖5. 與差異峰強度（DPI）相關的基因的功能分析。
圖6. 不同葉片發(fā)育階段調控DNA元件的鑒定。
圖2. 與ACRs相關的基因表達水平。
圖3. ACR在葉片發(fā)育過程中呈現動態(tài)變化。
圖4. 階段特異性ACR相關基因的功能分析。
圖5. 與差異峰強度（DPI）相關的基因的功能分析。
圖6. 不同葉片發(fā)育階段調控DNA元件的鑒定。
