Pipetty電動移液器在基孔肯雅病毒核酸檢測（實時熒光-PCR）中的應用
Pipetty電動移液器在基孔肯雅病毒核酸檢測（實時熒光-PCR）中的應用
方 案 摘 要：
本方案聚焦 Pipetty 電動移液器在基孔肯雅病毒核酸實時熒光 - PCR 檢測中的應用。該移液器憑借高精度、自動化及防污染設計，在檢測各環(huán)節(jié)發(fā)揮關鍵作用。在樣本前處理與 RNA 提取階段，微量分液功能提高 RNA 洗脫回收率；PCR 體系配制時，連續(xù)分液模式快速分配試劑，防污染吸頭避免氣溶膠污染；質(zhì)量控制中，精準移取對照品保證結果可靠。同時，其具備溫度補償功能、能減少人為誤差，提升效率與準確性，且維護成本低、合規(guī)性強，為檢測提供有力支持，保障結果的精準與可重復。
方 案 詳 情：
一、實驗原理
病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下產(chǎn)生cDNA，可作為聚合酶鏈(PCR)擴增反應的模版。TagMan探針實時熒光定量PCR時,在反應體系中加入一對病毒特異性引物和一條熒光基團標記的病毒特異性探針。Tagllan探針的兩端分別標記熒光報告基團和淬滅基團,在探針完好的情況下,報告基團發(fā)出的熒光信號被淬滅基團所吸收，因而檢測不到熒光信號。
在PCR擴增過程中，探針和引物與目標序列結合，當新生鏈沿著cDNA模板延伸到熒光標記的探針結合位點時，Tag酶發(fā)揮5'一3’核酸外切酶的功能，熒光報告基團與淬滅基團分離，熒光基團釋放熒光信號。這樣模板每擴增一次，就產(chǎn)生一個游離的熒光分子，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板可進行定量分析。其中RNA逆轉(zhuǎn)錄過程可以和PCR擴增反應同時進行也可先進行逆轉(zhuǎn)錄反應再進行PCR擴增。其他類似機制的熒光探針也可用于核酸檢測。
二、實驗準備
1、設配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-250及配套吸頭;
② 離心管(1.5 mL、0.2 mL 和 0.1 mL);
③ 試管架(5 mL、1.5 mL和 20μL );
④ 高速冷凍離心機;
⑤ 旋渦混合器;
⑥ 熒光定量 PCR 儀等;
2，試劑和材料
① 病毒核酸提取試劑盒;
② 熒光定量 RT-PCR試劑盒;
③ 引物及探針等(參考序列下):
CHIKV-FP：5’-TTTAGCCGTAATGAGCRTCGG-3'
CHIKV-RP：5’-CCGTGTTCGGGATCACTGTTA-3’
CHIKV-P：5’-FAMTGCCCACACTGTGA-BHQ1-3’(帶下劃線的堿基需要 LNA 修飾)。
三、實驗步驟
1、病毒 RNA 提�。捍龣z標本用病毒 RNA 提取試劑盒提取，操作步驟按說明書進行，制備的病毒核酸作為 Real-time RT-PCR的模板。
2、配置反應體系
| 2×RT-PCR 混合液 | 10 | 含酶、dNTPs 等基礎反應成分 |
| 上游引物（10μM） | 0.8 | 特異性結合 CHIKV cDNA 正義鏈 |
| 下游引物（10μM） | 0.8 | 特異性結合 CHIKV cDNA 反義鏈 |
| 熒光探針（10μM） | 0.4 | 結合靶序列，擴增時釋放熒光信號 |
| 模板 RNA | 5 | 待檢測的病毒 RNA（可根據(jù)濃度調(diào)整） |
| 無 RNA 酶水 | 3 | 補足體系至 20μL |
- 根據(jù)試驗要求設置陰性、陽性、內(nèi)參對照。
- 根據(jù)需要檢測的樣品數(shù)量，配制反應體系，將混合液、引物、探針、水充分混勻后分裝，使用Pipetty電動移液器的連續(xù)分液模式，設置每次分液量和連續(xù)分液次數(shù)，每管分液15μL，轉(zhuǎn)移反應管至樣品制備區(qū)。
5、自動更換吸頭，設置分液量和分液次數(shù)，吸取RNA溶液，在反應管中分別加入5μL RNA ，使每管總體積達到 20μL，記錄反應管對應的樣品編號。應注意操作過程中，每次操作都更換新的滅菌吸頭，嚴防不同樣品間的交叉污染。反應液分裝時避免產(chǎn)生氣泡，上機前檢查各反應管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄漏污染儀器。
6、Real-time RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄和擴增：一步法Real-time RT-PCR檢測反應條件為: 42℃ 15 min，95℃ 2min，95℃ 10 s，62℃ 30 s，45 個循環(huán)，儀器設置在每一循環(huán) 62℃退火/延伸步驟讀取熒光信號。該反應條件可根據(jù)采用的試劑要求進行適當?shù)恼{(diào)整。
四、試驗結果
1、以熒光 PCR 反應的前 3~15 個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，以本底信號標準差的 10 倍作為熒光閾值，標本擴增產(chǎn)生的熒光信號達到熒光閾值時所對應的循環(huán)數(shù)為循環(huán)閾值(Ct 值)。
2、檢測樣品的 Ct 值≤35.0，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，可報告樣品特異性核酸檢測陽性。檢測樣品的 Ct 值介于 35~45 之間時，屬臨界區(qū)間，建議重復檢測。若重復檢測結果 Ct 值≥45.0者為陰性；若 Ct值仍介于 35~45 之間，且擴增曲線有明顯的指數(shù)增長特征者，可報告樣品特異性核酸檢測陽性。
3、陽性對照的 Ct 值應≤32.0，并出現(xiàn)典型的“S”型擴增曲線；陰性對照 Ct 值應≥45；否則視為實驗結果無效，需重復檢測。
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