Pipetty在基孔肯雅病毒檢測（IGM抗體捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗）中的應用

方案摘要：本方案聚焦 Pipetty 電動移液器在基孔肯雅病毒核酸檢測（IgM 抗體捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗）中的應用。該移液器重量輕、體積小，重量僅 75g，操作舒適。它具備高精度等量連續(xù)分液功能，能以設定移液量多次重復排出。還配備溫度控制功能，可防止手熱導致精度下降。在檢測流程的包被抗體分液、樣本稀釋加樣等關鍵環(huán)節(jié)，其可有效提升檢測效率與準確性，降低實驗誤差，為基孔肯雅病毒檢測提供可靠助力 。
 
方案詳情：
一、實驗原理
      首先用抗人IgM μ鏈抗體(捕獲抗體)包被96孔板，如果待檢血清中存在CHIKV抗IgM抗體，則與包被的捕獲抗體結合，然后再與CHIKV抗原結合，最后與加入酶標抗CHIKV抗體結合，酶與顯色底物相互作用就會出現(xiàn)顯色反應。
 
二、‌實驗準備
1、設配和材料
① 包被液：碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液，pH 9.6，1.59g Na2C03，和 2.93g NaHC03溶解于1L水中;
② 洗液：磷酸鹽緩沖液(PBS)，含0.05%吐溫20，pH7.2;
③ 封閉液：含5%奶粉和 0.05%吐溫 20的 PBS；
④ 包被抗體：抗人IgMμ鏈抗體；
⑤ 病毒抗原：滅活的純化 CHIKV 抗原，無感染性；
⑥ 細胞抗原：經(jīng)純化的未感染病毒細胞培養(yǎng)液；
⑦ 酶標抗體：辣根過氧化物酶標記的 CHIKV單克隆抗體；
⑧ 酶底物：TMB；
⑨ 終止液：2N H2S04；
⑩ 臨床標本：急性期病人血清和/或腦脊髓液標本；陽性和陰性血清對照。
 
1、試劑和材料
① 平底 96 孔板。
② 洗板機。
③ 酶標儀。
④ 恒溫箱。
⑤ Pipetty電動移液器MSIC01-02-1000及滅菌吸頭。
⑥ 試劑儲液槽。
⑦ 保鮮袋。
⑧ 吸水紙。
 
三、實驗步驟
1、用記號筆在酶標板上標記實驗編號，明確每份臨床標本的位置。
2、用 pH 9.6的包被液按1∶2 000 比例稀釋抗人 IgMμ 鏈抗體，使用Pipetty電動移液器，設置連續(xù)分液功能，按 75 μL/孔等量加入到 96 孔板的孔中，4℃孵育過夜。
 
3、倒掉抗體包被液，把板中剩余液體在吸水紙上吸干。使用連續(xù)分液功能，每孔加入封閉液 200μL，封閉反應板。室溫孵育 30 min。
4、用洗液在自動洗板機上洗板5次。每次洗滌要保證每孔加滿洗液。
5、病人血清用稀釋液進行 1∶100 稀釋，腦脊髓液進行 1：10 稀釋，然后按 50 μL/孔，使用連續(xù)分液功能，各加2孔，同時用稀釋液按1∶100比例稀釋陽性對照血清和陰性對照血清，各加2孔。37℃濕盒孵育1h。洗滌5遍。
6、稀釋病毒抗原和細胞抗原。使用連續(xù)分液功能，每排左邊1孔按 50μL /孔加入病毒抗原，更換吸頭，每排右邊1孔按 50 μL/孔加入細胞抗原，4℃濕盒孵育過夜。洗滌5遍。
7、按 50 μL/孔加入辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體，37℃濕盒孵育1h，洗板5遍。
8、所有孔中加 50 μL/孔的 TB 底物液，包括1孔未加樣的空白對照孔。避光室溫孵育 10 min�？贵w陽性的孔中會逐漸顯示出藍色。
9、所有孔中加 50 μL/孔的終止液，顯示藍色的孔此時會變成黃色。把酶標板放入酶標儀中，在450 nm 波長處讀取 OD 值。
四、結果判讀
1、如果陽性對照血清病毒抗原孔的光密度(OD)值與細胞抗原孔的 0D 值之比≥2.1，檢測結果有效;
2、如果待檢標本病毒抗原孔的 0D 值與細胞抗原孔的 0D 值之比≥2.1，則可判定待檢標本中 CHIKV IgM 抗體陽性。