Pipetty在基孔肯雅病毒核酸檢測（間接免疫熒光法IFA）中的應用

方案摘要：本方案主要探討 Pipetty 電動移液器在基孔肯雅病毒核酸間接免疫熒光法（IFA）檢測中的具體應用。這款移液器擁有輕便小巧的特點，重量僅 75g，操作起來十分舒適。同時，它具備高精度的等量連續(xù)分液能力，能夠按照設(shè)定的移液量進行多次重復排液，并且配備了溫度控制功能，可避免因手部熱量影響而導致的精度降低。在檢測流程里，無論是，樣本稀釋還是連續(xù)加樣等關(guān)鍵步驟，該移液器都能發(fā)揮積極作用，有效提高檢測效率與準確性，減少實驗過程中的誤差，為基孔肯雅病毒的檢測工作提供堅實可靠的支持。

方案詳情：
一、實驗原理
       IFA就是先用待檢血清中的特異抗體（第一抗體）與固定在玻片上的CHIKV抗原反應，如果血清中存在CHIKV特異性IgM和IgG抗體，就會與熒光標記的抗人IgM和IgG抗體（第二抗體）結(jié)合，熒光顯微鏡下可見有特異熒光。
 
 
二、‌實驗準備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及滅菌吸頭；
② 熒光顯微鏡；
③ CHIKV抗原片（可用BHK-21、Vero 或 C6/36 等感染細胞制備，低溫、干燥、密封保存）；
④ 蓋玻片。

2、試劑和材料
① CHIKV抗體陽性對照血清、陰性對照血清；
② 熒光素標記抗人 IgG和IgM 熒光抗體；
③ 待檢患者血清標本；
④ 樣品稀釋液；
⑤ 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.2）；
⑥ 吐溫 20。

三、實驗步驟
1、取出抗原片，平衡至室溫；
2、如果檢測 IgG 抗體，先用標本稀釋液稀釋待檢血清，使用Pipetty電動移液器的單次移液和自動混勻功能，從1∶10 開始，快速的倍比稀釋至所需要的滴度；

3、使用Pipetty電動移液器，設(shè)置連續(xù)分液模式，每孔50μL加到每個反應區(qū)域（標本量以覆蓋所有反應區(qū)為準），同時設(shè)置陽性對照（按說明書稀釋）、陰性對照（同比例稀釋的陰性血清）和空白對照（僅加 PBS）；

4、將加有標本的抗原片放置在濕盒內(nèi)，37℃溫箱孵育 30min；
5、用含 2% 吐溫 20 的 PBS 沖洗抗原片，然后再漂洗 5 min；
6、取出抗原片，用吸水紙從抗原片背面和側(cè)面擦去洗液（不得擦拭反應區(qū)域），加入適量的熒光素標記抗人 IgM 或 IgG 熒光抗體，分別用于檢測IgM 或IgG 抗體（熒光抗體在使用前須根據(jù)說明書用 PBS 稀釋）；
7、將抗原片放置在避光的濕盒內(nèi)，37℃溫箱孵育 30 min；
8、用含 2% 吐溫20 的 PBS 沖洗抗原片，再將抗原片放入含有1：8000 伊文思藍的吐溫 20的PBS中漂洗 5 min；
9、取出抗原片，用吸水紙從抗原片背面和側(cè)面擦去洗液（不得擦拭反應區(qū)域），用甘油緩沖液封片，蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡；
10、熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
四、結(jié)果判讀
1、特異性熒光顆粒在鏡下呈現(xiàn)黃綠色，如果抗原片的細胞胞漿中呈現(xiàn)出均勻的顆粒狀熒光，可判斷 CHIKV 特異抗體陽性。
2、根據(jù)熒光光亮度和陽性細胞在細胞總數(shù)中所占的比例可將熒光反應大致區(qū)分為“+~ ++++6）無特異熒光者為陰性。檢測抗體滴度時，抗體滴度為特異熒光達“++”時最高血清稀釋度的倒數(shù)。
3、如果陽性對照顯示非特異性熒光或陰性對照顯示清晰的熒光，試驗則不成立，需重復檢測。