Pipetty電動移液器在動物布魯氏菌病檢測（多重PCR）中的應用
方案摘要：動物布魯氏菌病是由布魯氏菌屬細菌引發(fā)的人獸共患傳染病，對畜牧業(yè)及公共衛(wèi)生危害巨大。多重 PCR 檢測技術因能同時檢測多種靶標，提升檢測效率與準確性，在動物布魯氏菌病診斷中應用廣泛。Pipetty 電動移液器作為精準移液工具，在該檢測流程中發(fā)揮著關鍵作用。其高精度移液性能可確保 PCR 反應體系中各類試劑，如引物、探針、DNA 聚合酶、緩沖液及模板 DNA 等的添加量精準無誤，為反應提供穩(wěn)定可靠條件，減少因移液誤差導致的結果偏差。連續(xù)分液功能則在處理大量樣本時顯著提高移液效率，節(jié)省操作時間。此外，它還能有效規(guī)避手動移液因操作人員手法、力度差異造成的誤差，保障實驗的重復性與不同批次實驗結果的可比性。同時，Pipetty 電動移液器具備的溫度補償功能，可校正因手部溫度影響導致的分液量偏差，始終維持移液精度，尤其適用于長時間、大規(guī)模的動物布魯氏菌病檢測工作 。
方案詳情：
一、實驗原理
多重 PCR 通過在同一反應體系中設計多對特異性引物，同時靶向布魯氏菌屬保守基因（如bcsp31、16S rRNA）及生物種特異性序列（如IS711），經變性、退火、延伸循環(huán)實現(xiàn)靶基因同步擴增。擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳或熒光定量檢測，根據(jù)特異性條帶或熒光信號判斷是否存在布魯氏菌感染及菌種類型，兼具高效性與特異性，可同時完成病原鑒定與分型。
二、實驗準備
1、設配和材料
① 恒溫培養(yǎng)箱。
② PCR 擴增儀及配套的 PCR 反應管。
③ 電泳儀和電泳槽。
④ 凝膠成像系統(tǒng)或紫外透射儀。
⑤ 旋渦混勻器。
⑥ Ⅱ級生物安全柜。
⑦ 干式加熱器。
⑧ 水浴鍋。
⑨ 臺式高速冷凍離心機（離心力≥12000g）。
⑩ 冰箱（2℃~8 ℃、-20 ℃，-80 ℃）。
⑪ Pipetty電動移液器0.1-20 μL、1-250 μL、5-1000 μL及無菌槍頭。
2、試劑和材料
① 2×熒光 PCR 預混液（2×Buffer，含 0.05 U/μL, Taq 酶、0.4 mmol/L dNTPs 及4mmol/L 氯化鎂)。
② ddH2O、PBS（0.1 mol/L，pH 7.4）。
③ 陽性對照,為參考菌株（牛種,羊種、豬種、犬種布魯氏菌基因組以及 A19 和 S2疫苗株等）DNA，可使用 102CFU/mL~103CFU/mL的細菌 200 μL提取細菌 DNA。
④ 陰性對照，為ddH2O。
⑤ 細菌 DNA 提取試劑盒。
三、實驗步驟
1、疑似布魯氏菌分離株的滅活：在生物安全柜內，用接種環(huán)從培養(yǎng)皿上挑取單個疑似菌落或多個經純培養(yǎng)的疑似菌落，加入含 200 uL的 PBS 或 ddH2O 的離心管中，使用Pipetty電動移液器，設置自動混勻功能，吹打均勻，密封管蓋，置于干式加熱器，80 ℃滅活 2h。
2、將全血樣 、乳樣、組織樣、拭子樣及液體樣，進行處理后，置于干式加熱器或水浴鍋，80 ℃滅活2 h。
3、菌株及樣品 DNA提取，可采用細菌 DNA 提取試劑盒，按說明書規(guī)定程序提取樣品 DNA，也可采用酚-三氯甲烷-異戊醇抽提法，步驟如下：
a）使用Pipetty電動移液器取 200 μL 處理過的樣品放入離心管，加入裂解液（10 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaC1，0.5% SDS，200 μg/mL 蛋白酶K）200μL，56 ℃消化2h，12000g離心 20s，取上清液置于另一個管中，然后加入等體積的酚-三氯甲烷-異戊醇（25：24：1）混合物，上下顛倒3~4次混勻。
b）4℃ 7000g離心10 min，移上層液相置于另一個管中，加入 2.5倍體積預冷 70%（體積分數(shù)）乙醇，-20 ℃沉淀 30 min，12000g離心10 min，棄去液相，加入1mL 70%(體積分數(shù)）乙醇漂洗，12000g 離心 2 min~3 min，棄去液相，留取沉淀，真空或室溫干燥，加入 20μL ddH2O，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?br /> 4、按表3配制反應體系，在 PCR反應管中依次加入以下成分，充分混勻后，瞬時離心，確保所有反應成分混勻并集于管底，使用 PCR 反應混合液時，將試劑稀釋至工作濃度。
5、95 ℃預變性 5 min；然后 95 ℃變性 35s，64 ℃退火45 s，72 ℃延伸1min，進行 30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。
6、用 1XTAE 電泳緩沖液配制1.5% 瓊脂糖凝膠，按每100 mL凝膠溶液加入10 μL的比例加入核酸染料，倒凝膠平板；取 PCR產物5μL與1μL溴酚藍緩沖液，混合，加樣;加 DNA marker 作為分子質量對照。5 V/cm~8 V/cm 電泳 1h，置凝膠成像系統(tǒng)或紫外透射儀上觀察，拍照記錄檢測結果。
四、結果判定
1、陰性對照無特異性擴增產物，陽性對照有與分子質量相符的特異性擴增產物，試驗成立。
2、按F.3的判定標準，待檢驗樣品出現(xiàn)種特異擴增條帶，則判定為相應的布魯氏菌種:
a)擴增結果出現(xiàn)1682 bp 和 587 bp 兩條電泳帶時，判為牛種布魯氏菌；
b)擴增結果出現(xiàn)1682 bp、1071 bp 和 587 bp 三條電泳帶時，判為羊種布魯氏菌；
c)擴增結果出現(xiàn)1682bp、1071bp、587bp和 272bp 四條電泳帶時，判為豬種或犬種布魯氏菌；
d)擴增結果出現(xiàn)1682 bp 一條電泳帶時，判為A19 疫苗株;
e）擴增結果出現(xiàn)1071bp和587 bp 兩條電泳帶時，判為綿羊附睪種布魯氏菌。
方案詳情：
一、實驗原理
多重 PCR 通過在同一反應體系中設計多對特異性引物，同時靶向布魯氏菌屬保守基因（如bcsp31、16S rRNA）及生物種特異性序列（如IS711），經變性、退火、延伸循環(huán)實現(xiàn)靶基因同步擴增。擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳或熒光定量檢測，根據(jù)特異性條帶或熒光信號判斷是否存在布魯氏菌感染及菌種類型，兼具高效性與特異性，可同時完成病原鑒定與分型。
二、實驗準備
1、設配和材料
① 恒溫培養(yǎng)箱。
② PCR 擴增儀及配套的 PCR 反應管。
③ 電泳儀和電泳槽。
④ 凝膠成像系統(tǒng)或紫外透射儀。
⑤ 旋渦混勻器。
⑥ Ⅱ級生物安全柜。
⑦ 干式加熱器。
⑧ 水浴鍋。
⑨ 臺式高速冷凍離心機（離心力≥12000g）。
⑩ 冰箱（2℃~8 ℃、-20 ℃，-80 ℃）。
⑪ Pipetty電動移液器0.1-20 μL、1-250 μL、5-1000 μL及無菌槍頭。
2、試劑和材料
① 2×熒光 PCR 預混液（2×Buffer，含 0.05 U/μL, Taq 酶、0.4 mmol/L dNTPs 及4mmol/L 氯化鎂)。
② ddH2O、PBS（0.1 mol/L，pH 7.4）。
③ 陽性對照,為參考菌株（牛種,羊種、豬種、犬種布魯氏菌基因組以及 A19 和 S2疫苗株等）DNA，可使用 102CFU/mL~103CFU/mL的細菌 200 μL提取細菌 DNA。
④ 陰性對照，為ddH2O。
⑤ 細菌 DNA 提取試劑盒。
三、實驗步驟
1、疑似布魯氏菌分離株的滅活：在生物安全柜內，用接種環(huán)從培養(yǎng)皿上挑取單個疑似菌落或多個經純培養(yǎng)的疑似菌落，加入含 200 uL的 PBS 或 ddH2O 的離心管中，使用Pipetty電動移液器，設置自動混勻功能，吹打均勻，密封管蓋，置于干式加熱器，80 ℃滅活 2h。
2、將全血樣 、乳樣、組織樣、拭子樣及液體樣，進行處理后，置于干式加熱器或水浴鍋，80 ℃滅活2 h。
3、菌株及樣品 DNA提取，可采用細菌 DNA 提取試劑盒，按說明書規(guī)定程序提取樣品 DNA，也可采用酚-三氯甲烷-異戊醇抽提法，步驟如下：
a）使用Pipetty電動移液器取 200 μL 處理過的樣品放入離心管，加入裂解液（10 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaC1，0.5% SDS，200 μg/mL 蛋白酶K）200μL，56 ℃消化2h，12000g離心 20s，取上清液置于另一個管中，然后加入等體積的酚-三氯甲烷-異戊醇（25：24：1）混合物，上下顛倒3~4次混勻。
b）4℃ 7000g離心10 min，移上層液相置于另一個管中，加入 2.5倍體積預冷 70%（體積分數(shù)）乙醇，-20 ℃沉淀 30 min，12000g離心10 min，棄去液相，加入1mL 70%(體積分數(shù)）乙醇漂洗，12000g 離心 2 min~3 min，棄去液相，留取沉淀，真空或室溫干燥，加入 20μL ddH2O，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?br /> 4、按表3配制反應體系，在 PCR反應管中依次加入以下成分，充分混勻后，瞬時離心，確保所有反應成分混勻并集于管底，使用 PCR 反應混合液時，將試劑稀釋至工作濃度。
5、95 ℃預變性 5 min；然后 95 ℃變性 35s，64 ℃退火45 s，72 ℃延伸1min，進行 30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。
6、用 1XTAE 電泳緩沖液配制1.5% 瓊脂糖凝膠，按每100 mL凝膠溶液加入10 μL的比例加入核酸染料，倒凝膠平板；取 PCR產物5μL與1μL溴酚藍緩沖液，混合，加樣;加 DNA marker 作為分子質量對照。5 V/cm~8 V/cm 電泳 1h，置凝膠成像系統(tǒng)或紫外透射儀上觀察，拍照記錄檢測結果。
四、結果判定
1、陰性對照無特異性擴增產物，陽性對照有與分子質量相符的特異性擴增產物，試驗成立。
2、按F.3的判定標準，待檢驗樣品出現(xiàn)種特異擴增條帶，則判定為相應的布魯氏菌種:
a)擴增結果出現(xiàn)1682 bp 和 587 bp 兩條電泳帶時，判為牛種布魯氏菌；
b)擴增結果出現(xiàn)1682 bp、1071 bp 和 587 bp 三條電泳帶時，判為羊種布魯氏菌；
c)擴增結果出現(xiàn)1682bp、1071bp、587bp和 272bp 四條電泳帶時，判為豬種或犬種布魯氏菌；
d)擴增結果出現(xiàn)1682 bp 一條電泳帶時，判為A19 疫苗株;
e）擴增結果出現(xiàn)1071bp和587 bp 兩條電泳帶時，判為綿羊附睪種布魯氏菌。
