Pipetty電動(dòng)移液器在動(dòng)物布魯氏菌病檢測(cè)（試管凝集實(shí)驗(yàn)）中的應(yīng)用

方案摘要：本方案主要闡述了 Pipetty 電動(dòng)移液器在動(dòng)物布魯氏菌病試管凝集實(shí)驗(yàn)（SAT）中的應(yīng)用。其憑借精準(zhǔn)的血清梯度稀釋、抗原懸液添加功能，有效減少人為誤差，保障反應(yīng)體系比例恒定；自動(dòng)吸排與混勻功能，確�？乖�-抗體充分結(jié)合。同時(shí)，Pipetty電動(dòng)移液器的連續(xù)分液模式提升檢測(cè)效率，精度穩(wěn)定，無需頻繁校準(zhǔn)，可有效保障體積精度，為動(dòng)物布魯氏菌病的高效、可靠檢測(cè)提供有力支持。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
      布魯氏菌試管凝集實(shí)驗(yàn)（SAT）基于抗原 - 抗體特異性結(jié)合原理。用滅活布魯氏菌菌體抗原與倍比稀釋的待檢血清混合，37℃孵育后，若血清含特異性抗體（IgM、IgG 等），會(huì)與抗原表面脂多糖等抗原決定簇結(jié)合，通過橋聯(lián)作用使抗原顆粒凝集，形成肉眼可見的絮狀或顆粒狀凝集物，液體變澄清，以此判斷血清中是否存在布魯氏菌抗體，輔助診斷感染。
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① 恒溫培養(yǎng)箱。
② 振蕩器。
③ 比濁儀。
④ Pipetty電動(dòng)移液器1-250、5-1000量程和配套無菌吸頭、玻璃試管及試管架。
 
2、試劑和材料
① 布魯氏菌試管凝集試驗(yàn)抗原。
② 布魯氏菌陽性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清。
③ 含 0.5% 苯酚的生理鹽水。
④ 含 0.5% 苯酚的 10% 氯化鈉溶液。
⑤ 參照比濁管。

三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、對(duì) 牛（馬、鹿、駱駝）血清進(jìn)行稀釋，每份血清用 4支試管，使用Pipetty電動(dòng)移液器在第1管加 960 μL稀釋液（含 0.5%苯酚的生理鹽水），第2管~第4管各加入 500 μL稀釋液，然后取待檢血清 40 μL，加入第1管內(nèi)，并混合均勻；取 500μL混合液加入第2管并充分混勻，如此倍比稀釋至第4管；從第4管取混勻液 500 μL 棄去。
注：稀釋完畢，血清從第1管至第4管的血清稀釋度分別為1：25、1：50、1：100和1：200。
 
2、對(duì) 羊（豬、犬）血清進(jìn)行稀釋，每份血清用 4支試管；第1管加 920 μL稀釋液（含 0.5% 苯酚的 10% 氯化鈉溶液）；第2管~第4 管各加入 500 μL稀釋液；然后取待檢血清 80μL，加入第1管內(nèi)，并混合均勻；取 500μL混合液加入第2管并充分混勻，如此倍比稀釋至第4管；從第4管取混勻液 500 μL 棄去。
注：稀釋完畢，血清從第1管至第4管的血清稀釋度分別為1：12.5、1：25、1：50和1：100。
3、用含 0.5% 苯酚的生理鹽水稀釋抗原到工作抗原。
4、分別取 500 μL稀釋好的工作抗原，加入上述各孔已稀釋好的血清中，設(shè)置自動(dòng)混勻功能，一鍵混勻。注：牛（馬、鹿，駱駝）的血清稀釋度則依次變?yōu)?：50、1：100、1：200和1：400：羊（豬，犬）的血清稀釋度則依次變?yōu)?：25、1：50、1：100和1：200。
5、完成上述加樣后，將試管放置恒溫恒濕培養(yǎng)箱，37 ℃孵育 18 h~24 h。
6、取出試管，與制備的比濁管進(jìn)行比較，觀察并記錄結(jié)果。
7、每次試驗(yàn)時(shí)均應(yīng)設(shè)陽性血清對(duì)照、陰性血清對(duì)照和抗原對(duì)照。陰性血清對(duì)照和陽性血清對(duì)照的稀釋與待檢血清來源的動(dòng)物種相同；抗原對(duì)照稀釋到規(guī)定容量，取 500 μL，再加 500μL 稀釋液，觀察抗原是否有自凝現(xiàn)象。
8、凝集反應(yīng)程度分為5個(gè)等級(jí)（參照比濁管，按各試管上層液體清亮度判讀）：
a） ++++：菌體完全凝集和沉淀，液體 100% 清亮；
b） +++：菌體幾乎完全凝集和沉淀，液體 75% 清亮；
c） ++：菌體有顯著凝集和沉淀，液體 50%清亮；
d） +：有清楚可見的凝集和沉淀，液體 25% 清亮；
e） -：無凝集和沉淀，液體均勻渾濁。
9、同時(shí)滿足下列條件，判定試驗(yàn)條件成立：
a）陽性對(duì)照血清出現(xiàn)完全凝集“++++”
b）陰性對(duì)照血清無凝集“-”
c）抗原對(duì)照無自凝“-”
四、結(jié)果判定
1、實(shí)驗(yàn)條件成立的情況下，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果作出陽性、可疑、陰性的判定。
a）陽性結(jié)果：-牛、馬、鹿、駱駝血清 1：100稀釋，出現(xiàn)“++”及以上凝集；--豬、山羊、綿羊、犬血清 1：50 稀釋，出現(xiàn)“++”及以上凝集。
b）可疑結(jié)果：--牛、馬、鹿、駱駝血清 1：50 稀釋，出現(xiàn)“++”以上凝集；--豬、山羊、綿羊、犬血清 1：25 稀釋，出現(xiàn)“++”以上凝集。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果為“可疑”的動(dòng)物，應(yīng)于3周~4 周后重新采血檢驗(yàn)，若為可疑，判為陽性。
c）陰性結(jié)果：待檢血清出現(xiàn)“-”，即不出現(xiàn)任何凝集，判定為陰性。