Pipetty電動(dòng)移液器在動(dòng)物布魯氏菌病檢測(cè)（熒光RAA）中的應(yīng)用

方案摘要：本方案聚焦 Pipetty 電動(dòng)移液器在動(dòng)物布魯氏菌病熒光 RAA（重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增）檢測(cè)中的應(yīng)用，通過(guò)精準(zhǔn)移液、高效分液與智能操作三大核心優(yōu)勢(shì)，顯著提升檢測(cè)效率與準(zhǔn)確性。Pipetty 憑借高精度移液及溫度補(bǔ)償功能，確保反應(yīng)體系中引物、探針等關(guān)鍵試劑添加量的一致性，有效降低假陰性與假陽(yáng)性率；其連續(xù)分液模式可使 96 孔板操作時(shí)間縮短 80%，為動(dòng)物疫病快速診斷提供標(biāo)準(zhǔn)化、可追溯的解決方案，尤其適用于基層獸醫(yī)站、海關(guān)口岸等檢測(cè)場(chǎng)景。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
      動(dòng)物布魯氏菌病熒光 RAA 檢測(cè)基于重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。在 37-42℃恒溫下，重組酶與引物結(jié)合形成復(fù)合物，識(shí)別并結(jié)合布魯氏菌 DNA 模板，解開(kāi)雙鏈啟動(dòng)擴(kuò)增；單鏈結(jié)合蛋白穩(wěn)定單鏈結(jié)構(gòu)，鏈置換 DNA 聚合酶延伸新鏈，實(shí)現(xiàn)指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。引物或探針標(biāo)記熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)，擴(kuò)增過(guò)程中熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，釋放熒光信號(hào)，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度判斷樣本中是否存在布魯氏菌 DNA，實(shí)現(xiàn)快速、靈敏檢測(cè)。​
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Ⅱ級(jí)生物安全柜。
② 干式加熱器。
③ 水浴鍋。
④ 熒光 PCR 擴(kuò)增儀及配套 PCR 管。
⑤ 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（離心力≥12000g）。
⑥ 冰箱（2 ℃~8 ℃、-20 ℃，-80 ℃）。
⑦ Pipetty電動(dòng)移液器0.1-20 μL、1-250 μL、5-1000 μL）及無(wú)菌槍頭。
⑧ 恒溫?zé)晒饣�因檢測(cè)儀及配套反應(yīng)管。
⑨ 樣品前處理系統(tǒng)。
 
2、試劑和材料
① 熒光基礎(chǔ)反應(yīng)單元（含重組酶,單鏈結(jié)合蛋白和 DNA 聚合酶的凍干粉）及配套緩沖液。
② 乙酸鎂（140 mmol/L）。
③ 陽(yáng)性對(duì)照，為參考菌株（牛種、羊種、豬種、犬種布魯氏菌基因組以及 A19 和 S2 疫苗株等） DNA，可使用 10² CFU/mL~10³ CFU/mL 的細(xì)菌 200 μL 提取細(xì)菌DNA。
④ 陰性對(duì)照，為 ddH₂O。
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、疑似布魯氏菌分離株的滅活：在生物安全柜內(nèi)，用接種環(huán)從培養(yǎng)皿上挑取單個(gè)疑似菌落或多個(gè)經(jīng)純培養(yǎng)的疑似菌落，加入含 200 uL的 PBS 或 ddH₂O 的離心管中，使用Pipetty電動(dòng)移液器，設(shè)置自動(dòng)混勻功能，吹打均勻，密封管蓋，置于干式加熱器，80 ℃滅活 2h。
 
2、將全血樣 、乳樣、組織樣、拭子樣及液體樣，進(jìn)行處理后，置于干式加熱器或水浴鍋，80 ℃滅活2 h。
3、菌株及樣品 DNA提取，可采用細(xì)菌 DNA 提取試劑盒，按說(shuō)明書(shū)規(guī)定程序提取樣品 DNA，也可采用酚-三氯甲烷-異戊醇抽提法，步驟如下：
a）使用Pipetty電動(dòng)移液器取 200 μL 處理過(guò)的樣品放入離心管，加入裂解液（10 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaC1，0.5% SDS，200 μg/ml 蛋白酶K）200μL，56 ℃消化2h，12000g離心 20s，取上清液置于另一個(gè)管中，然后加入等體積的酚-三氯甲烷-異戊醇（25：24：1）混合物，上下顛倒3~4次混勻。
b）4℃ 7000g離心10 min，移上層液相置于另一個(gè)管中，加入 2.5倍體積預(yù)冷 70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇，-20 ℃沉淀 30 min，12000g離心10 min，棄去液相，加入1mL 70%(體積分?jǐn)?shù)）乙醇漂洗，12000g 離心 2 min~3 min，棄去液相，留取沉淀，真空或室溫干燥，加入 20μL ddH₂O，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?br /> 4、按表2配制RAA反應(yīng)混合液。
 
5、將 40 μLRAA 反應(yīng)混合液加入 RAA 熒光基礎(chǔ)反應(yīng)單元管中。
6、將 5μL 乙酸鎂（反應(yīng)催化劑）加在反應(yīng)單元管蓋內(nèi)側(cè)。
7、向反應(yīng)單元管中依次加入 5μL 待測(cè)核酸，最后扣緊反應(yīng)單元管蓋。
8、將反應(yīng)單元管置于樣品前處理系統(tǒng)中，39 ℃下按程序運(yùn)行 4 min。
9、將反應(yīng)單元管放入恒溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀，設(shè)置擴(kuò)增溫度為 39 ℃，擴(kuò)增時(shí)間 30 min，每隔 20s收集熒光信號(hào)。注：樣品前處理系統(tǒng)和恒溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀提前 30 min預(yù)熱。
四、結(jié)果判定
1、同時(shí)滿(mǎn)足以下條件，可判定試驗(yàn)成立，否則應(yīng)重新試驗(yàn)。
a)陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線(xiàn)，擴(kuò)增曲線(xiàn)的斜率K≥20；
b)陰性對(duì)照無(wú)特異性擴(kuò)增曲線(xiàn)，擴(kuò)增曲線(xiàn)的斜率K<20。
2、在滿(mǎn)足上述的條件下，當(dāng)樣品擴(kuò)增曲線(xiàn)的斜率 K≥20 時(shí)，可判為陽(yáng)性，否則判為陰性。