Pipetty電動移液器在動物布魯氏菌病檢測（微量法）中的應(yīng)用

方案摘要：本方案圍繞 Pipetty 電動移液器在動物布魯氏菌病微量法中的應(yīng)用展開。通過其高精度移液功能，精準控制關(guān)鍵試劑添加量，顯著降低假陰性與假陽性率；連續(xù)分液模式可實現(xiàn) 96 孔板快速操作，使加樣效率提升 70%；Pipetty 電動移液器的應(yīng)用，有效解決傳統(tǒng)手動移液的誤差大、效率低等問題，為基層獸醫(yī)站、海關(guān)口岸等機構(gòu)開展動物布魯氏菌病微量法檢測，提供高效、準確、可靠的技術(shù)支持。
 
方案詳情：
一、實驗原理
      布魯氏菌病微量法檢測基于抗原 - 抗體反應(yīng)原理。布魯氏菌試管凝集試驗抗原與待檢動物血清中的布魯氏菌抗體相遇，若血清中存在相應(yīng)抗體，便會發(fā)生特異性結(jié)合，形成肉眼可見的凝集物。通過觀察凝集反應(yīng)的程度和結(jié)果，結(jié)合陽性、陰性對照，判斷待檢動物血清中是否含有布魯氏菌抗體，從而確定動物是否感染布魯氏菌病 。
二、‌實驗準備
1、設(shè)配和材料
① 恒溫培養(yǎng)箱。
② 振蕩器。
③ Pipetty電動移液器1-250、5-1000量程及配套吸頭、96 孔U形反應(yīng)板。
④ 薄膜、濕盒（帶蓋子長方形容器，底部鋪一層濕紗布或濕水紙）。
 
2、試劑和材料
① 布魯氏菌試管凝集試驗抗原。
② 布魯氏菌陽性對照血清和陰性對照血清。
③ 含 0.5% 苯酚的生理鹽水。
④ 含 0.5% 苯酚的 10% 氯化鈉溶液。

三、實驗步驟
1、將牛（馬、鹿、駱駝）血清稀釋，每份血清用4個連續(xù)的U形孔；使用Pipetty電動移液器在反應(yīng)板的第1孔加 192μL稀釋液（含 0.5%苯酚的生理鹽水）；設(shè)置連續(xù)分液模式，在第 2孔~第 4孔等量加入100μL稀釋液；取待檢血清8μL，加入第1孔，使用自動混勻模式，一鍵混勻；從第1孔吸取 100μL，混合液加入第2孔自動混勻，如此倍比稀釋至第4孔，從第4孔棄去混合液 100μL。
注：稀釋完畢，血清從第1孔至第4孔的血清稀釋度分別為1：25、1：50、1：100和1：200。
 
2、對羊（豬、犬）血清進行稀釋，每份血清用 4個連續(xù)的U形孔，在反應(yīng)板的第1孔加184μL，稀釋液（含 0.5%苯酚的 10% 氯化鈉溶液），第 2孔~第 4孔等量加入100μL稀釋液；取待檢血清 16μL，加入第1孔，自動混勻；從第1孔吸取 100μL混合液加入第2孔自動混勻，如此倍比稀釋至第4孔，從第 4孔棄去混合液100μL。
注：稀釋完畢，血清從第1孔至第4孔的血清稀釋度分別為1：12.5、1：25、1：50和1：100。
3、用含 0.5%苯酚的生理鹽水稀釋液稀釋成工作抗原。
4、分別取 100μL 稀釋好的工作抗原，使用 Pipetty 電動移液器加入上述各孔稀釋好的血清中，并振蕩混勻。注：牛血清稀釋度則依次變?yōu)?：50、1：100、1：200和 1：400；羊血清稀釋度則依次變?yōu)?：25、1：50、1：100和1：200。
5、完成上述加樣后，用薄膜將反應(yīng)板嚴密封蓋后，放入濕盒，并置恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃孵育 18h~24h。
6、取出反應(yīng)板，觀察并記錄結(jié)果。7、每次試驗時均應(yīng)設(shè)陽性血清對照、陰性血清對照和抗原對照。陰性血清對照和陽性血清對照的稀釋與待檢血清相同；抗原對照按說明書稀釋到規(guī)定容量，取 500μL，再加500μL稀釋液，觀察抗原是否有自凝現(xiàn)象。
8、凝集反應(yīng)程度分為5個等級：
    a）++++：菌體完全凝集，1孔~4 孔凝集物呈傘狀均勻鋪于孔；
    b）+++：菌體幾乎完全凝集，1孔~3孔凝集物呈傘狀均勻鋪于孔底，第4孔孔底呈現(xiàn)白色點狀；
    c）++：菌體凝集顯著，1孔~2 孔凝集物呈傘狀均勻鋪于孔底，3孔~4孔孔底呈現(xiàn)白色點狀；
    d）+：凝集物有沉淀，第1孔凝集物呈傘狀均勻鋪于孔底，2孔~4 孔孔底呈現(xiàn)白色點狀；
    e）-：無凝集，1孔~4孔孔底均呈現(xiàn)白色點狀。
9、 同時滿足下列條件，判定試驗條件成立：
   a）陽性對照血清出現(xiàn)完全凝集“++++”；
   b）陰性對照血清無凝集“-”；
   c）抗原對照無自凝“-”。
 
四、結(jié)果判定
符合試驗成立的條件下，結(jié)果判定如下：
a）待檢血清出現(xiàn)“++”及以上凝集現(xiàn)象時，判定為陽性；
b）待檢血清出現(xiàn)“+”凝集現(xiàn)象時，判定為可疑；
c）待檢血清出現(xiàn)“-”時，判定為陰性。
注：對試驗結(jié)果為“可疑”的動物，應(yīng)于3周~4周后重新采血檢驗，若為可疑，判為陽性。