實時熒光定量PCR檢測支原體步驟介紹

熒光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR)是1996年由美國Applied Biosystems 公司推出的一種核酸新定量試驗技術，熒光定量PCR是在常規(guī)PCR基礎上加入熒光探針或相應的熒光染料來實現(xiàn)實時定量的。隨著PCR反應的進行，PCR反應產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一次熒光信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線。在實時熒光定量PCR技術中Ct值是指每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

實時熒光定量PCR檢測支原體主要的步驟包括支原體特異引物和探針的設計，陽性標準品的制備及標準曲線的繪制，熒光定量PCR特異性實驗，敏感性實驗和重復性實驗，最后是用待測細胞上清液上機檢測，通過Ct值及擴增曲線判斷。隨著實時熒光定量PCR的使用，出現(xiàn)了很多利用此技術檢測支原體的研究，Lorenzon S等利用熒光定量PCR方法檢測肺炎支原體capripneumoniae等，2017年Gerlier等發(fā)明了利用熒光定量PCR檢測支原體的專利。實時熒光定量PCR簡化了操作步驟，采用閉管檢測可避免PCR跑膠導致的氣溶膠假陽性的出現(xiàn)，敏感性高，可以實現(xiàn)實時監(jiān)控，還可以實現(xiàn)定量判斷。實時熒光定量PCR具有比PCR檢測快，靈敏度高的優(yōu)勢，尤其適合樣品模板含量較低時使用，實時熒光定量PCR能通過溶解曲線能夠判斷特異性擴增。實時熒光定量PCR需要配套價格高昂的熒光定量PCR儀器，而且設備維護費用高，機器設置操作復雜，需專業(yè)人員，難以得到全面推廣。

環(huán)介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)是一種新興的基因擴增技術，由日本學者Notomi 2000年在Nucleic AcidsRes雜志上公開發(fā)表，作為一種分子生物學檢測技術，現(xiàn)先已廣泛應用于分子檢測領域，2005年Saito R等人發(fā)表了LAMP法快速檢測肺炎支原體的文章。2014年HEYing等用LAMP方法快速檢測capripneumoniae支原體，2016年美國Jonas M等發(fā)明了利用LAMP方法檢測肺炎支原體的專利。 2016年曹振發(fā)明了一種檢測廣譜支原體的LAMP方法的專利。2017年Matsuzaki I等使用LAMP用于基因轉移的快速檢測。LAMP原理是針對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(如Bst 酶)的作用下，水浴鍋中63℃左右，60分鐘即可實現(xiàn)109～1010倍的核酸擴增，具有很高的擴增效率，操作簡單，檢測不需要使用特殊的儀器。LAMP雖然增加了擴增效率，但引物間的非特異性配對容易導致假陽性結果，限制了LAMP方法的使用。

由于實時熒光定量PCR需要配套的儀器，且操作復雜，需要有經(jīng)驗的實驗人員對檢測結果進行分析，而LAMP法會出現(xiàn)假陽性問題，使實時熒光定量PCR和LAMP法在檢測支原體污染上都存在一定的弊端，為了尋求一種使用簡單，結果準確支原體檢測方法，出現(xiàn)了利用支原體酶這一特定活性檢測支原體的ATP酶法，如Lonza公司推出的商品化的Mycoalert支原體檢測試劑盒，ATP酶法是采用生物發(fā)光的原理，檢測支原體酶活性，其檢測的支原體酶廣泛存在于180多種支原體中，而這種酶不存在于真核細胞中。當支原體被裂解后，釋放的酶與反應底物發(fā)生催化反應，將ADP轉化成ATP，通過熒光分光光度計測量樣品中添加底物前后ATP的含量，可以得到一個比率，該比率指示支原體是否存在。如果這些酶不存在，第二次讀數(shù)相對于第一次讀數(shù)就沒有增加，如果酶與底物進行特異性反應，就會導致ATP含量上升。ATP含量的上升通過生物發(fā)光化學反應可以檢測到，讀數(shù)上升表明存在支原體污染。