FLAG親和標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢及精準(zhǔn)去除方法

在重組蛋白表達和純化過程中，為了便于純化和檢測，通常會在目的蛋白上添加親和標(biāo)簽（affinity tag）。其中，F(xiàn)LAG (DYKDDDDK, DDDDK等)標(biāo)簽是常用的，因為這些標(biāo)簽的表達載體是廣泛可用的。

一、Flag 融合標(biāo)簽的獨特結(jié)構(gòu)
Flag 融合標(biāo)簽由八個氨基酸（DYKDDDDK）組成，看似簡單卻蘊含著精妙的設(shè)計。其結(jié)構(gòu)短小精悍，這一特點為后續(xù)的編碼和操作帶來極大便利。在這個八肽序列中，芳香族氨基酸發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們是抗原 - 抗體相互作用的主要參與者。序列中的第二個氨基酸 Tyr 尤為重要，其左側(cè)與帶負電的 Asp 相連，這種組合增強了 Tyr 的抗原性。而 Tyr 下游的六個氨基酸（Lys - Asp - Asp - Asp - Asp - Lys）形成了高度親水的序列，該序列能夠塑造出高度暴露的三維蛋白質(zhì)構(gòu)型，從而展現(xiàn)出強大的抗原性。正是這種獨特的結(jié)構(gòu)，使得 Flag 短肽能夠高效地發(fā)揮蛋白質(zhì)標(biāo)簽的功能。

二、Flag 融合標(biāo)簽的顯著優(yōu)勢

1.編碼簡易
僅由八個氨基酸構(gòu)成的 Flag 序列，編碼時只需一條人工合成的寡核苷酸鏈即可完成。相比其他復(fù)雜的標(biāo)簽，這種簡易的編碼方式大大降低了實驗成本和操作難度，提高了實驗效率，為科研人員節(jié)省了大量的時間和精力。

2.切割位點靈活
Flag 標(biāo)簽含有腸激酶切割位點，腸激酶能夠精準(zhǔn)識別短肽 C 端的五個氨基酸（DDDDK）。通過腸激酶處理，科研人員可以輕松除去標(biāo)簽，獲得天然的非融合蛋白質(zhì)，這對于需要研究蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)和功能的實驗至關(guān)重要，確保了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

3.融合位置多樣
Flag 抗原標(biāo)簽的融合位置十分靈活，可以被融合到目的蛋白質(zhì)的 N 端或 C 端。研究表明，融合在 N 端的 FLAG 序列穩(wěn)定性良好，在大腸桿菌等表達系統(tǒng)中不會被蛋白酶輕易除去，并且在酵母和大腸桿菌中的表達性質(zhì)相似。此外，當(dāng)目的蛋白 N 端融合了 Flag 多肽后，C 末端還能繼續(xù)融合其他模塊或不同的親和配體，為蛋白質(zhì)的多功能研究和應(yīng)用提供了廣闊空間。

三、精準(zhǔn)去除 Flag 標(biāo)簽的方法
在蛋白研究過程中，有時需要去除 Flag 標(biāo)簽以獲得純凈的目標(biāo)蛋白。目前常用的標(biāo)簽切除方法主要包括兩類：一是利用特異性蛋白酶進行酶切；二是在融合蛋白中引入蛋白內(nèi)含肽系統(tǒng)。其中，蛋白酶切除法是應(yīng)用最廣泛的方法，常用的蛋白酶包括：腸激酶（enterokinase）、凝血酶、Xa因子、煙草蝕紋病毒蛋白酶（TEV）、genenaseⅠ和3C蛋白酶等，這些蛋白酶都能在融合標(biāo)簽與目的蛋白之間特定位點進行切割。

1. 腸激酶切除法：
腸激酶是去除N端Flag標(biāo)簽最常用的蛋白酶，能精確識別D-D-D-D-K五肽序列。其切割效率主要取決于賴氨酸（K）后的第一個氨基酸殘基。Flag標(biāo)簽（DYKDDDDK）本身就含有腸激酶識別位點，酶切后可獲得僅保留4個氨基酸殘基的短肽標(biāo)簽。研究人員已成功克隆表達牛腸激酶催化亞基，該酶具有活性高、pH適應(yīng)范圍廣等優(yōu)點，且能在多種變性劑和去污劑條件下保持切割活性，切割產(chǎn)物不含多余氨基酸殘基。

Hosfield等采用不依賴連接的克隆技術(shù)（LIC），在Flag標(biāo)簽與目的蛋白之間引入特定氨基酸殘基（X），構(gòu)建了-DYKDDDDK-X-R序列（R代表目的蛋白）。以鈣調(diào)蛋白基因為模型，系統(tǒng)研究了X殘基對酶切效率的影響。實驗結(jié)果顯示：當(dāng)X為Lys、Ala、Leu、Ile、Phe、Glu、Met、Asp或Asn時，切割效率可達80%以上；而當(dāng)X為Tyr或Pro時，由于空間位阻效應(yīng)，切割效率會降至70%以下。這一發(fā)現(xiàn)對獲得天然蛋白具有重要意義。因此，我們可以采用LIC技術(shù)將Flag標(biāo)簽直接連接目的基因，表達純化后通過腸激酶切除標(biāo)簽，從而獲得具有天然結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)。

2. 凝血酶切割
凝血酶也是一種應(yīng)用廣泛的蛋白酶，不過它在切割重組蛋白后，會在切割位點的 C 端保留兩個氨基酸殘基。凝血酶可以識別兩種類型的氨基酸序列，對 X4 - X3 - P - P [K] - X1΄ - X2΄ 這種序列的識別效果更佳。在一些對蛋白質(zhì) C 端氨基酸序列要求不那么嚴格的實驗中，凝血酶可作為去除 Flag 標(biāo)簽的選擇之一。

3. Xa 因子切割
Xa 因子是一種高效的去除融合標(biāo)簽的工具酶，它能夠特異性識別 I - E [D] - G - R - X1 序列，并從融合標(biāo)簽的 C 末端進行切除。在特定的實驗條件和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)下，Xa 因子能夠發(fā)揮其高效切割的優(yōu)勢，為科研人員提供了另一種去除 Flag 標(biāo)簽的有效途徑。

Flag 融合標(biāo)簽憑借其獨特的結(jié)構(gòu)、顯著的優(yōu)勢、多樣的抗體種類以及靈活的標(biāo)簽去除方法，在蛋白純化與研究領(lǐng)域占據(jù)著重要地位。

產(chǎn)品信息


參考文獻
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