ELISA實驗中的常見問題及解決方案
ELISA是蛋白定量的金標(biāo)準(zhǔn)，也是免疫學(xué)研究中最常用的實驗方法之一。ELISA中出現(xiàn)的各種常見問題，現(xiàn)分析一下：
一、標(biāo)曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色
溶解標(biāo)準(zhǔn)品以及倍比稀釋時，未渦旋震蕩或不夠充分。標(biāo)準(zhǔn)品溶解時，需要渦旋震蕩，以保證充分溶解。在做倍比稀釋時，也要渦旋震蕩以保證充分混勻。單純依靠移液器反復(fù)吹打，效率較低、效果也不一定最佳。
二、標(biāo)曲和樣本均不顯色
在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸，導(dǎo)致顯色偏弱。推薦孵育階段，使用ELISA專用的微孔板振蕩器，調(diào)至合適的頻率，使抗原抗體充分接觸，保證結(jié)合效果。
如果排除上述原因，有可能是漏加了某個組分，如檢測抗體、酶等。對于比較馬虎的新手，一定要做好標(biāo)記和記錄，或者使用添加染料的ELISA試劑盒。
三、標(biāo)曲顯色，樣本不顯色
遇到這種情況，很多人覺得是試劑盒問題，這其實是一個誤區(qū)。任何一種實驗方法，都有其局限性，當(dāng)樣本中目的蛋白濃度極低或者樣本中干擾因素較強，就無法檢測到。目前ELISA仍然是蛋白檢測靈敏度最高的方法，與不同技術(shù)結(jié)合后，衍生出了多種類型的ELISA，提高了檢測靈敏度。如采用信號增強劑的高敏ELISA、ECL為底物的化學(xué)發(fā)光ELISA、采用熒光法檢測的ELISA、結(jié)合PCR擴增的免疫PCR等等。
對于目的蛋白濃度特別低的樣本，可以嘗試用高敏ELISA，但這也并不意味著一定能檢測到樣本濃度，只能說可以提高樣本的可測率，并使結(jié)果更加可靠。因為通常用普通ELISA檢測的樣本OD值都偏低，甚至低于標(biāo)準(zhǔn)品濃度最低的S7點，雖然可以計算得到數(shù)值，但實際上這個數(shù)值的可信度已經(jīng)降低了。而高敏ELISA可提高樣本OD值，使之盡量位于標(biāo)曲范圍內(nèi)，得到的數(shù)值也更加可信。需要指出的是，國內(nèi)某些所謂的高敏ELISA試劑盒，并沒有采用信號增強劑的方法，而只是簡單地提高了抗體濃度，較普通ELISA其靈敏度的提升有限。
四、標(biāo)曲和樣本都顯色，但復(fù)孔的CV大
這個問題就跟移液器和實驗者的操作有關(guān)了。移液器的使用維護不規(guī)范，就會造成移液的誤差較大。實驗者自身的操作習(xí)慣、加樣的一致性對復(fù)孔的CV也有很大影響。大家可以參考關(guān)于移液器使用的文章，正確使用和維護移液器。個人的操作可以在空白板上練習(xí)移液動作，或者在幾十個離心管中加入相同體積的水，通過電子天平稱量，檢驗移液的精密度。同時還需練習(xí)加快加樣速度，減少從第一個樣本到最后一個樣本加樣時間過長導(dǎo)致的差異。
五、本底偏高，樣本值測不到
標(biāo)曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對于高敏ELISA可以適當(dāng)放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時候，本底過高會掩蓋目的信號，導(dǎo)致無法測到樣本值。
在加入TMB顯色后，需實時觀察標(biāo)曲顯色情況。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍色，即可終止反應(yīng)。
六、樣本經(jīng)不同梯度稀釋，計算得到的樣本值差異較大
有時候我們不清楚樣本中目的蛋白的濃度如何，應(yīng)該如何稀釋，那么我們就會做下預(yù)實驗，確定稀釋倍數(shù)。然而有時候同一樣本做了幾個不同梯度稀釋后，計算得到的樣本值之間差異較大，應(yīng)該選擇哪一個稀釋倍數(shù)呢？
這里涉及到了基質(zhì)效應(yīng)。通常血清樣本加樣量較高時，血清中的各種蛋白會抑制抗原抗體的接觸，基質(zhì)效應(yīng)較明顯。而經(jīng)過稀釋后，干擾因素也隨之稀釋，影響就會較小。當(dāng)某兩個梯度稀釋后，計算得到的樣本值接近時，我們就可以認為在該稀釋梯度時，樣本中的干擾因素影響較小，計算得到的值也是接近真實的。然而這樣的稀釋是針對目的蛋白濃度較高的樣本而言。對于濃度很低的樣本，經(jīng)過多倍稀釋后，就更加測不到了，此時可按照廠家說明書推薦的加樣方式操作。
七、同一樣本使用不同廠家的ELISA試劑盒檢測，計算得到的樣本值差異較大
這里涉及到另一個評估試劑盒性能的參數(shù)——校準(zhǔn)。不同廠家采用的標(biāo)準(zhǔn)品可能有所不同，對其定量的方法和標(biāo)準(zhǔn)也不同，這就是企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。因此哪怕是同一個標(biāo)準(zhǔn)品，在不同廠家各自的實驗條件下測定，結(jié)果可能也會差異很大。
因此，我們并不建議將不同廠家的結(jié)果進行對比，除非他們都是用國際標(biāo)準(zhǔn)品進行了校準(zhǔn)。然而，并非所有蛋白都有國際標(biāo)準(zhǔn)品，因此使用不同廠家的產(chǎn)品計算的樣本值差異較大的現(xiàn)象也在所難免。
但都用同一廠家的試劑盒檢測樣本，那么結(jié)果還是可以進行統(tǒng)計學(xué)分析的。
八、不同試劑盒中的組分能否通用
除非是公用的試劑如洗液、檢測緩沖液，其它組分不建議用其它試劑盒的組分，甚至是同一指標(biāo)不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包括標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、檢測抗體、酶等)都是經(jīng)過優(yōu)化的，如果貿(mào)然使用其它試劑盒的組分，有可能對結(jié)果產(chǎn)生影響。
一、標(biāo)曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色
溶解標(biāo)準(zhǔn)品以及倍比稀釋時，未渦旋震蕩或不夠充分。標(biāo)準(zhǔn)品溶解時，需要渦旋震蕩，以保證充分溶解。在做倍比稀釋時，也要渦旋震蕩以保證充分混勻。單純依靠移液器反復(fù)吹打，效率較低、效果也不一定最佳。
二、標(biāo)曲和樣本均不顯色
在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸，導(dǎo)致顯色偏弱。推薦孵育階段，使用ELISA專用的微孔板振蕩器，調(diào)至合適的頻率，使抗原抗體充分接觸，保證結(jié)合效果。
如果排除上述原因，有可能是漏加了某個組分，如檢測抗體、酶等。對于比較馬虎的新手，一定要做好標(biāo)記和記錄，或者使用添加染料的ELISA試劑盒。
三、標(biāo)曲顯色，樣本不顯色
遇到這種情況，很多人覺得是試劑盒問題，這其實是一個誤區(qū)。任何一種實驗方法，都有其局限性，當(dāng)樣本中目的蛋白濃度極低或者樣本中干擾因素較強，就無法檢測到。目前ELISA仍然是蛋白檢測靈敏度最高的方法，與不同技術(shù)結(jié)合后，衍生出了多種類型的ELISA，提高了檢測靈敏度。如采用信號增強劑的高敏ELISA、ECL為底物的化學(xué)發(fā)光ELISA、采用熒光法檢測的ELISA、結(jié)合PCR擴增的免疫PCR等等。
對于目的蛋白濃度特別低的樣本，可以嘗試用高敏ELISA，但這也并不意味著一定能檢測到樣本濃度，只能說可以提高樣本的可測率，并使結(jié)果更加可靠。因為通常用普通ELISA檢測的樣本OD值都偏低，甚至低于標(biāo)準(zhǔn)品濃度最低的S7點，雖然可以計算得到數(shù)值，但實際上這個數(shù)值的可信度已經(jīng)降低了。而高敏ELISA可提高樣本OD值，使之盡量位于標(biāo)曲范圍內(nèi)，得到的數(shù)值也更加可信。需要指出的是，國內(nèi)某些所謂的高敏ELISA試劑盒，并沒有采用信號增強劑的方法，而只是簡單地提高了抗體濃度，較普通ELISA其靈敏度的提升有限。
四、標(biāo)曲和樣本都顯色，但復(fù)孔的CV大
這個問題就跟移液器和實驗者的操作有關(guān)了。移液器的使用維護不規(guī)范，就會造成移液的誤差較大。實驗者自身的操作習(xí)慣、加樣的一致性對復(fù)孔的CV也有很大影響。大家可以參考關(guān)于移液器使用的文章，正確使用和維護移液器。個人的操作可以在空白板上練習(xí)移液動作，或者在幾十個離心管中加入相同體積的水，通過電子天平稱量，檢驗移液的精密度。同時還需練習(xí)加快加樣速度，減少從第一個樣本到最后一個樣本加樣時間過長導(dǎo)致的差異。
五、本底偏高，樣本值測不到
標(biāo)曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對于高敏ELISA可以適當(dāng)放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時候，本底過高會掩蓋目的信號，導(dǎo)致無法測到樣本值。
在加入TMB顯色后，需實時觀察標(biāo)曲顯色情況。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍色，即可終止反應(yīng)。
六、樣本經(jīng)不同梯度稀釋，計算得到的樣本值差異較大
有時候我們不清楚樣本中目的蛋白的濃度如何，應(yīng)該如何稀釋，那么我們就會做下預(yù)實驗，確定稀釋倍數(shù)。然而有時候同一樣本做了幾個不同梯度稀釋后，計算得到的樣本值之間差異較大，應(yīng)該選擇哪一個稀釋倍數(shù)呢？
這里涉及到了基質(zhì)效應(yīng)。通常血清樣本加樣量較高時，血清中的各種蛋白會抑制抗原抗體的接觸，基質(zhì)效應(yīng)較明顯。而經(jīng)過稀釋后，干擾因素也隨之稀釋，影響就會較小。當(dāng)某兩個梯度稀釋后，計算得到的樣本值接近時，我們就可以認為在該稀釋梯度時，樣本中的干擾因素影響較小，計算得到的值也是接近真實的。然而這樣的稀釋是針對目的蛋白濃度較高的樣本而言。對于濃度很低的樣本，經(jīng)過多倍稀釋后，就更加測不到了，此時可按照廠家說明書推薦的加樣方式操作。
七、同一樣本使用不同廠家的ELISA試劑盒檢測，計算得到的樣本值差異較大
這里涉及到另一個評估試劑盒性能的參數(shù)——校準(zhǔn)。不同廠家采用的標(biāo)準(zhǔn)品可能有所不同，對其定量的方法和標(biāo)準(zhǔn)也不同，這就是企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。因此哪怕是同一個標(biāo)準(zhǔn)品，在不同廠家各自的實驗條件下測定，結(jié)果可能也會差異很大。
因此，我們并不建議將不同廠家的結(jié)果進行對比，除非他們都是用國際標(biāo)準(zhǔn)品進行了校準(zhǔn)。然而，并非所有蛋白都有國際標(biāo)準(zhǔn)品，因此使用不同廠家的產(chǎn)品計算的樣本值差異較大的現(xiàn)象也在所難免。
但都用同一廠家的試劑盒檢測樣本，那么結(jié)果還是可以進行統(tǒng)計學(xué)分析的。
八、不同試劑盒中的組分能否通用
除非是公用的試劑如洗液、檢測緩沖液，其它組分不建議用其它試劑盒的組分，甚至是同一指標(biāo)不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包括標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、檢測抗體、酶等)都是經(jīng)過優(yōu)化的，如果貿(mào)然使用其它試劑盒的組分，有可能對結(jié)果產(chǎn)生影響。
- AIP的作用機制及在植物學(xué)研究中從代謝解析到抗病研究的應(yīng)用
- RSL3鐵死亡激動劑誘導(dǎo)機制及其在抗腫瘤研究中的應(yīng)用
- PMA佛波酯佛波酯的作用機制及在誘導(dǎo)細胞分化、構(gòu)建炎癥模型上的應(yīng)用
- DNA與DNA酶的調(diào)控機制、功能及兩者的協(xié)同作用
- 核酸內(nèi)切酶DNase I的結(jié)構(gòu)、功能與多元應(yīng)用
- DLL3配體的結(jié)構(gòu)、功能機制及在肺癌治療與腫瘤研究中的作用
- FLAG親和標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢及精準(zhǔn)去除方法
- 睡眠壓力的線粒體起源及大腦中分子變化與睡眠需求的關(guān)聯(lián)
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com