免疫熒光技術(shù)（IF實(shí)驗(yàn)）問題分析
免疫熒光技術(shù)（IF實(shí)驗(yàn)）原理：免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。
問題分析：
1、目標(biāo)蛋白的熒光很弱，導(dǎo)致組間差異并不明顯，造成假陰性結(jié)果。
這種情況出現(xiàn)后，首先要檢查一下抗體對不對，是否適用于你的預(yù)處理組織。一個典型的例子就是，有些抗體只適用于冰凍切片，但若將其應(yīng)用于石蠟切片，就會造成弱標(biāo)記或無標(biāo)記現(xiàn)象。
然后通過文獻(xiàn)等查找一下目標(biāo)蛋白在該組織或細(xì)胞的表達(dá)豐度如何。若該蛋白本身表達(dá)就很少，那就沒啥可說的，你的結(jié)果應(yīng)該沒問題。
此外，如果抗體修復(fù)不充分，抗原表位未完全暴露，也會出現(xiàn)弱標(biāo)記現(xiàn)象。比如，盡管大多數(shù)抗體都是在酸性環(huán)境中修復(fù)，但是也存在少量的抗體需要在堿性環(huán)境中修復(fù)，建議查看抗體說明書，嚴(yán)格按照其修復(fù)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2、目標(biāo)蛋白的熒光太強(qiáng)，甚至形成非特異性的標(biāo)記，一些背景染色可能被誤認(rèn)為陽性區(qū)域，造成假陽性結(jié)果
這種情況一般出現(xiàn)在抗體濃度過高而漂洗又不充分的時候。多余的抗體會吸附在組織上，造成熒光圖像整體高背景。
改進(jìn)方法是適當(dāng)降低一抗或者二抗的濃度，增加漂洗時間，一般能夠有所改善。
3、DAPI染細(xì)胞核時，加入的試劑太多，造成高背景染色
現(xiàn)在都是使用的防熒光衰減DAPI試劑，使用時滴上一滴就能將細(xì)胞核標(biāo)記。
但是這也帶來一個小問題。滴加的量太多時，會造成整張圖像呈現(xiàn)出藍(lán)色的背景。采集得到的圖像會很不好看，如果單純使用γ值曲線去調(diào)整，圖像中的細(xì)胞核會呈現(xiàn)出假假的感覺，像是P上去的。
因此，滴加的DAPI不要太多，只需覆蓋上薄薄的一層即可。事實(shí)上，個人認(rèn)為只要切片沒有暴露在自然光或者激發(fā)光之下，熒光的自然衰減并沒有想象中那么快。
4、組織切片預(yù)處理不當(dāng)或采用石蠟切片，導(dǎo)致高背景染色
如果組織切片，尤其是石蠟切片脫蠟環(huán)節(jié)不徹底，也會造成區(qū)域性的非特異性標(biāo)記。建議脫蠟一定要徹底，脫蠟前充分烤片也可以幫助脫蠟。
實(shí)驗(yàn)過程中，玻片干燥了，同樣會造成高背景或大面積的非特異性標(biāo)記。漂洗環(huán)節(jié)和抗體孵育環(huán)節(jié)最容易出現(xiàn)干片現(xiàn)象，尤其是大批量實(shí)驗(yàn)時，一定要注意。使用免疫組化專用筆畫個圈，可以有效改善。
5、采集圖像過程不當(dāng)，導(dǎo)致原始圖像不佳，直接影響后續(xù)半定量分析
采集圖像時不要對每一張圖像都加上標(biāo)尺，否則后期采用Image J或者IPP進(jìn)行分析時，這些標(biāo)尺會對結(jié)果造成影響。
采集圖像時，速度要快。如果激發(fā)光很長時間對準(zhǔn)目標(biāo)區(qū)域，此區(qū)域內(nèi)的熒光衰減會極快，有經(jīng)驗(yàn)的人都知道，不必多說。因此，目標(biāo)區(qū)域較小時，一定要盡量快速采集，減少人為實(shí)驗(yàn)誤差。
采集圖像時，必須固定一個γ值，不可以在采集過程中修改。因?yàn)椋?gamma;值確實(shí)可以改善圖像的某些瑕疵，但是這樣一來，圖像的熒光分布和強(qiáng)度會受到γ值的極大影響。調(diào)整幅度太大，更會造成熒光假假的感覺，非常失真。
當(dāng)然了，后期半定量分析時，如果一定要調(diào)整γ值，那也是對整批次圖像的統(tǒng)一調(diào)整，而不是某幾張圖像。千萬別走入造假的險境之中。
問題分析：
1、目標(biāo)蛋白的熒光很弱，導(dǎo)致組間差異并不明顯，造成假陰性結(jié)果。
這種情況出現(xiàn)后，首先要檢查一下抗體對不對，是否適用于你的預(yù)處理組織。一個典型的例子就是，有些抗體只適用于冰凍切片，但若將其應(yīng)用于石蠟切片，就會造成弱標(biāo)記或無標(biāo)記現(xiàn)象。
然后通過文獻(xiàn)等查找一下目標(biāo)蛋白在該組織或細(xì)胞的表達(dá)豐度如何。若該蛋白本身表達(dá)就很少，那就沒啥可說的，你的結(jié)果應(yīng)該沒問題。
此外，如果抗體修復(fù)不充分，抗原表位未完全暴露，也會出現(xiàn)弱標(biāo)記現(xiàn)象。比如，盡管大多數(shù)抗體都是在酸性環(huán)境中修復(fù)，但是也存在少量的抗體需要在堿性環(huán)境中修復(fù)，建議查看抗體說明書，嚴(yán)格按照其修復(fù)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2、目標(biāo)蛋白的熒光太強(qiáng)，甚至形成非特異性的標(biāo)記，一些背景染色可能被誤認(rèn)為陽性區(qū)域，造成假陽性結(jié)果
這種情況一般出現(xiàn)在抗體濃度過高而漂洗又不充分的時候。多余的抗體會吸附在組織上，造成熒光圖像整體高背景。
改進(jìn)方法是適當(dāng)降低一抗或者二抗的濃度，增加漂洗時間，一般能夠有所改善。
3、DAPI染細(xì)胞核時，加入的試劑太多，造成高背景染色
現(xiàn)在都是使用的防熒光衰減DAPI試劑，使用時滴上一滴就能將細(xì)胞核標(biāo)記。
但是這也帶來一個小問題。滴加的量太多時，會造成整張圖像呈現(xiàn)出藍(lán)色的背景。采集得到的圖像會很不好看，如果單純使用γ值曲線去調(diào)整，圖像中的細(xì)胞核會呈現(xiàn)出假假的感覺，像是P上去的。
因此，滴加的DAPI不要太多，只需覆蓋上薄薄的一層即可。事實(shí)上，個人認(rèn)為只要切片沒有暴露在自然光或者激發(fā)光之下，熒光的自然衰減并沒有想象中那么快。
4、組織切片預(yù)處理不當(dāng)或采用石蠟切片，導(dǎo)致高背景染色
如果組織切片，尤其是石蠟切片脫蠟環(huán)節(jié)不徹底，也會造成區(qū)域性的非特異性標(biāo)記。建議脫蠟一定要徹底，脫蠟前充分烤片也可以幫助脫蠟。
實(shí)驗(yàn)過程中，玻片干燥了，同樣會造成高背景或大面積的非特異性標(biāo)記。漂洗環(huán)節(jié)和抗體孵育環(huán)節(jié)最容易出現(xiàn)干片現(xiàn)象，尤其是大批量實(shí)驗(yàn)時，一定要注意。使用免疫組化專用筆畫個圈，可以有效改善。
5、采集圖像過程不當(dāng)，導(dǎo)致原始圖像不佳，直接影響后續(xù)半定量分析
采集圖像時不要對每一張圖像都加上標(biāo)尺，否則后期采用Image J或者IPP進(jìn)行分析時，這些標(biāo)尺會對結(jié)果造成影響。
采集圖像時，速度要快。如果激發(fā)光很長時間對準(zhǔn)目標(biāo)區(qū)域，此區(qū)域內(nèi)的熒光衰減會極快，有經(jīng)驗(yàn)的人都知道，不必多說。因此，目標(biāo)區(qū)域較小時，一定要盡量快速采集，減少人為實(shí)驗(yàn)誤差。
采集圖像時，必須固定一個γ值，不可以在采集過程中修改。因?yàn)椋?gamma;值確實(shí)可以改善圖像的某些瑕疵，但是這樣一來，圖像的熒光分布和強(qiáng)度會受到γ值的極大影響。調(diào)整幅度太大，更會造成熒光假假的感覺，非常失真。
當(dāng)然了，后期半定量分析時，如果一定要調(diào)整γ值，那也是對整批次圖像的統(tǒng)一調(diào)整，而不是某幾張圖像。千萬別走入造假的險境之中。
- AIP的作用機(jī)制及在植物學(xué)研究中從代謝解析到抗病研究的應(yīng)用
- RSL3鐵死亡激動劑誘導(dǎo)機(jī)制及其在抗腫瘤研究中的應(yīng)用
- PMA佛波酯佛波酯的作用機(jī)制及在誘導(dǎo)細(xì)胞分化、構(gòu)建炎癥模型上的應(yīng)用
- DNA與DNA酶的調(diào)控機(jī)制、功能及兩者的協(xié)同作用
- 核酸內(nèi)切酶DNase I的結(jié)構(gòu)、功能與多元應(yīng)用
- DLL3配體的結(jié)構(gòu)、功能機(jī)制及在肺癌治療與腫瘤研究中的作用
- FLAG親和標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢及精準(zhǔn)去除方法
- 睡眠壓力的線粒體起源及大腦中分子變化與睡眠需求的關(guān)聯(lián)
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com