核酸內(nèi)切酶DNase I的結(jié)構(gòu)、功能與多元應(yīng)用

一、DNase I 的結(jié)構(gòu)與酶學(xué)特性
DNase I 是一種非特異性核酸內(nèi)切酶，能夠高效地消化單鏈或雙鏈 DNA。它通過水解磷酸二酯鍵，將 DNA 切割成含有 5'- 磷酸基團(tuán)和 3'-OH 基團(tuán)的單脫氧核苷酸和寡脫氧核苷酸。這一水解過程，就像是一把精密的分子剪刀，在 DNA 的鏈條上精準(zhǔn)地進(jìn)行裁剪。

其最佳工作 pH 范圍為 7 - 8，這一酸堿環(huán)境與大多數(shù)生物體內(nèi)的生理環(huán)境相契合，確保了它在生物樣本處理中的有效性。同時(shí)，DNase I 的活性高度依賴于 Ca2+，并且可以被多種二價(jià)金屬離子如 Mn2+、Mg2+、Zn2 + 等激活。在不同二價(jià)金屬離子存在的條件下，DNase I 展現(xiàn)出不同的切割特性。當(dāng) Mg2 + 存在時(shí)，它如同隨機(jī)游走的工匠，隨機(jī)剪切雙鏈 DNA 的任意位點(diǎn)；而在 Mn2 + 存在時(shí)，它則像一位嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕ㄖ�師，在同一位點(diǎn)剪切 DNA 雙鏈，形成平末端或 1 - 2 個(gè)核苷酸突出的粘末端。這些獨(dú)特的切割特性，為科研人員在不同實(shí)驗(yàn)需求下對 DNA 進(jìn)行精準(zhǔn)處理提供了有力的工具。

常見的 DNase I 主要來源于牛胰腺純化或通過重組技術(shù)制備。與從牛胰腺中純化的 DNase I 相比，重組酶具有顯著優(yōu)勢。由于其來源的特殊性，重組 DNase I 的內(nèi)源性 RNase 水平相對較低，甚至能夠制備成無 RNase 的產(chǎn)品形式。這一特性使得它在對 RNase 敏感的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中表現(xiàn)卓越，比如從 RNA 樣品中去除 DNA 時(shí)，能夠最大程度地保護(hù) RNA 的完整性，避免 RNA 受到 RNase 的降解，從而確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

二、RNA 研究中的關(guān)鍵助力
在 RNA 研究領(lǐng)域，RNA 樣本的質(zhì)量直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和科學(xué)性。然而，在 RNA 提取過程中，基因組 DNA（gDNA）的殘留是一個(gè)常見且棘手的問題。gDNA 的殘留可能會干擾下游實(shí)驗(yàn)，如在 mRNA 表達(dá)量分析、轉(zhuǎn)錄組分析等實(shí)驗(yàn)中，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差。因此，在進(jìn)行這些具有挑戰(zhàn)性的下游應(yīng)用之前，使用 DNase I 對 RNA 樣本進(jìn)行處理，消化殘留的 gDNA 成為了關(guān)鍵步驟。

這一處理過程可以靈活地在 RNA 提取期間、提取后或者反轉(zhuǎn)錄之前進(jìn)行。在 RNA 提取期間加入 DNase I，可以在源頭減少 gDNA 的污染；提取后處理則更加靈活，方便科研人員根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行操作；而在反轉(zhuǎn)錄之前使用 DNase I，能夠確保反轉(zhuǎn)錄過程中不會受到 gDNA 的干擾，保證 cDNA 的質(zhì)量，為后續(xù)的基因表達(dá)分析等實(shí)驗(yàn)提供可靠的模板。

體外轉(zhuǎn)錄（IVT）是合成 RNA 的重要方法，它以 DNA 為模板，在相應(yīng)底物和緩沖液的作用下，通過 RNA 聚合酶的催化合成 RNA。然而，合成后的 RNA 中往往會殘留 DNA，這些殘留的 DNA 會對下游實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生不利影響。例如，在 mRNA 疫苗開發(fā)過程中，殘留 DNA 的去除至關(guān)重要。它不僅可以降低下游純化的難度，還能提高產(chǎn)品的純度，保障疫苗的安全性和有效性。在這一過程中，Recombinant DNase I (RNase-free) 成為了去除模板 DNA 的得力助手，其高效的 DNA 消化能力和無 RNase 的特性，確保了 RNA 產(chǎn)物的高質(zhì)量。

三、rRNA 去除的得力助手
在生物體內(nèi)，rRNA 的豐度極高且序列非常保守。雖然 rRNA 在細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成過程中扮演著重要角色，但在 RNA 建庫測序等研究中，高豐度的 rRNA 會掩蓋其他低豐度 RNA 的信息，對獲取生物信息研究造成干擾。因此，在 RNA 建庫測序前，通常需要先將 rRNA 去除。

目前，rRNA 的去除方式以 RNA 酶消法為主，DNase I 在其中發(fā)揮著不可或缺的作用。在這一方法中，首先提取 Total RNA，然后設(shè)計(jì)并合成與 rRNA 特異性結(jié)合的單鏈 DNA 探針，讓單鏈 DNA 探針與 rRNA 分子雜交結(jié)合。接著，利用 RNase H 降解雜交的 rRNA，最后使用 DNase I 降解 DNA 探針，成功實(shí)現(xiàn) rRNA 的去除，留下非 rRNA 的 RNA 模板。這一過程中，DNase I 精確地降解 DNA 探針，保證了去除 rRNA 的同時(shí)不會對其他 RNA 造成損傷，為后續(xù)的 RNA 建庫測序提供了高質(zhì)量的模板。

四、DNA 標(biāo)記與分析的利器
缺口平移法是實(shí)驗(yàn)室常用的脫氧核糖核酸探針標(biāo)記方法，它的實(shí)現(xiàn)離不開 DNase I 與 E.coli DNA Polymerase I 的協(xié)同作用。DNase I 首先在待標(biāo)記的雙鏈 DNA 的每一條鏈上產(chǎn)生若干個(gè)單鏈缺口，這些缺口形成 3’羥基末端，為后續(xù)反應(yīng)提供了起始位點(diǎn)。隨后，E.coli DNA Polymerase I 發(fā)揮其 5’→3’外切酶活性，從缺口處 5’端切除一個(gè)核苷酸，同時(shí)利用其 5’→3’聚合酶活性將一個(gè)帶標(biāo)記的核苷酸引入到缺口的 3' 端，修補(bǔ)缺口。隨著這一過程的不斷重復(fù)，缺口在 DNA 鏈上移動，標(biāo)記的核苷酸就逐漸摻入到新合成的 DNA 鏈中，實(shí)現(xiàn)了 DNA 的標(biāo)記。這一方法在基因探針制備、基因定位等研究中具有廣泛應(yīng)用，為科研人員追蹤和分析特定 DNA 序列提供了有力手段。

DNase I 足跡法分析實(shí)驗(yàn)是精確鑒定 DNA 結(jié)合蛋白在 DNA 分子上結(jié)合位點(diǎn)的重要檢測方法。其原理基于蛋白與 DNA 結(jié)合后，能夠保護(hù)結(jié)合部位不被 DNase I 破壞。在實(shí)驗(yàn)中，先對待檢雙鏈 DNA 分子進(jìn)行單鏈末端標(biāo)記，然后將蛋白質(zhì)和 DNA 混合，加入適量的 DNase I 進(jìn)行酶切。這一過程需要精確控制酶的用量，確保相鄰的 DNA 片段只相差一個(gè)核苷酸，同時(shí)設(shè)置未加蛋白質(zhì)的對照。酶切結(jié)束后，從 DNA 上除去蛋白質(zhì)，將變性的 DNA 用 PAGE 電泳分離，通過放射自顯影，與對照組對比，就能解讀出足跡部位的核苷酸序列。這一實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究中具有重要意義，通過確定轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白與啟動子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)，幫助科研人員深入了解基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控機(jī)制。

產(chǎn)品信息


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