實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)支原體步驟介紹

熒光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR)是1996年由美國(guó)Applied Biosystems 公司推出的一種核酸新定量試驗(yàn)技術(shù)，熒光定量PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光探針或相應(yīng)的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量的。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中Ct值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)支原體主要的步驟包括支原體特異引物和探針的設(shè)計(jì)，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，熒光定量PCR特異性實(shí)驗(yàn)，敏感性實(shí)驗(yàn)和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，最后是用待測(cè)細(xì)胞上清液上機(jī)檢測(cè)，通過(guò)Ct值及擴(kuò)增曲線判斷。隨著實(shí)時(shí)熒光定量PCR的使用，出現(xiàn)了很多利用此技術(shù)檢測(cè)支原體的研究，Lorenzon S等利用熒光定量PCR方法檢測(cè)肺炎支原體capripneumoniae等，2017年Gerlier等發(fā)明了利用熒光定量PCR檢測(cè)支原體的專利。實(shí)時(shí)熒光定量PCR簡(jiǎn)化了操作步驟，采用閉管檢測(cè)可避免PCR跑膠導(dǎo)致的氣溶膠假陽(yáng)性的出現(xiàn)，敏感性高，可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)控，還可以實(shí)現(xiàn)定量判斷。實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有比PCR檢測(cè)快，靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，尤其適合樣品模板含量較低時(shí)使用，實(shí)時(shí)熒光定量PCR能通過(guò)溶解曲線能夠判斷特異性擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR需要配套價(jià)格高昂的熒光定量PCR儀器，而且設(shè)備維護(hù)費(fèi)用高，機(jī)器設(shè)置操作復(fù)雜，需專業(yè)人員，難以得到全面推廣。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)是一種新興的基因擴(kuò)增技術(shù)，由日本學(xué)者Notomi 2000年在Nucleic AcidsRes雜志上公開發(fā)表，作為一種分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，現(xiàn)先已廣泛應(yīng)用于分子檢測(cè)領(lǐng)域，2005年Saito R等人發(fā)表了LAMP法快速檢測(cè)肺炎支原體的文章。2014年HEYing等用LAMP方法快速檢測(cè)capripneumoniae支原體，2016年美國(guó)Jonas M等發(fā)明了利用LAMP方法檢測(cè)肺炎支原體的專利。 2016年曹振發(fā)明了一種檢測(cè)廣譜支原體的LAMP方法的專利。2017年Matsuzaki I等使用LAMP用于基因轉(zhuǎn)移的快速檢測(cè)。LAMP原理是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(如Bst 酶)的作用下，水浴鍋中63℃左右，60分鐘即可實(shí)現(xiàn)109～1010倍的核酸擴(kuò)增，具有很高的擴(kuò)增效率，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)不需要使用特殊的儀器。LAMP雖然增加了擴(kuò)增效率，但引物間的非特異性配對(duì)容易導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，限制了LAMP方法的使用。

由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR需要配套的儀器，且操作復(fù)雜，需要有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)人員對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，而LAMP法會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性問題，使實(shí)時(shí)熒光定量PCR和LAMP法在檢測(cè)支原體污染上都存在一定的弊端，為了尋求一種使用簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確支原體檢測(cè)方法，出現(xiàn)了利用支原體酶這一特定活性檢測(cè)支原體的ATP酶法，如Lonza公司推出的商品化的Mycoalert支原體檢測(cè)試劑盒，ATP酶法是采用生物發(fā)光的原理，檢測(cè)支原體酶活性，其檢測(cè)的支原體酶廣泛存在于180多種支原體中，而這種酶不存在于真核細(xì)胞中。當(dāng)支原體被裂解后，釋放的酶與反應(yīng)底物發(fā)生催化反應(yīng)，將ADP轉(zhuǎn)化成ATP，通過(guò)熒光分光光度計(jì)測(cè)量樣品中添加底物前后ATP的含量，可以得到一個(gè)比率，該比率指示支原體是否存在。如果這些酶不存在，第二次讀數(shù)相對(duì)于第一次讀數(shù)就沒有增加，如果酶與底物進(jìn)行特異性反應(yīng)，就會(huì)導(dǎo)致ATP含量上升。ATP含量的上升通過(guò)生物發(fā)光化學(xué)反應(yīng)可以檢測(cè)到，讀數(shù)上升表明存在支原體污染。