PCR試劑盒DNA合成步驟介紹

目前引物合成主要采用固相亞磷酰胺三酯法進(jìn)行。基于該方法的DNA合成儀有多種，由ABI/PE公司生產(chǎn)的高通量DNA自動(dòng)合成儀得到了廣泛的應(yīng)用。各合成儀進(jìn)行引物合成的原理基本相同，主要區(qū)別在于合成產(chǎn)率的高低、試劑消耗量和單個(gè)循環(huán)用時(shí)等。生工公司采用的合成儀主要機(jī)型為全新的ABI3900高通量合成儀。
固相亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。該方法是在固相載體上完成DNA鏈的合成的，DNA化學(xué)合成不同于酶促的DNA合成過程從5’ →3’方向延伸，而是由3’端開始，相鄰的核苷酸通過3’→ 5’磷酸二酯鍵連接。
1、脫保護(hù)基 (Deblocking)
用三氯乙酸 (Trichloroacetic Acid，TCA) 脫去連結(jié)在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保護(hù)基團(tuán)DMT (二甲氧基三苯甲基)，獲得游離的5'-羥基端，以供下一步縮合反應(yīng)。

2、活化 (Activation)
將亞磷酰胺保護(hù)的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并進(jìn)入合成柱，形成亞磷酰胺四唑活性中間體 (其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保護(hù))，此中間體將與GPG上的已脫保護(hù)基的核苷酸發(fā)生縮合反應(yīng)。

3、連接 (Coupling)
亞磷酰胺四唑活性中間體遇到CPG上已脫保護(hù)基的核苷酸時(shí)，將與其5'-羥基發(fā)生親合反應(yīng)，縮合并脫去四唑，此時(shí)合成的寡核苷酸鏈向前延長(zhǎng)一個(gè)堿基。

4、封閉 (Capping)
縮合反應(yīng)后，為了防止連在CPG上的未參與反應(yīng)的5'-羥基在隨后的循環(huán)反應(yīng)中被延伸，常通過乙�；瘉矸忾]此端羥基，一般乙�；�試劑是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。

5、氧化 (Oxidation)
縮合反應(yīng)時(shí)核苷酸單體是通過亞磷酯鍵與連在CPG上的寡核苷酸連接，而亞磷酯鍵不穩(wěn)定，易被酸、堿水解，此時(shí)常用碘的四氫呋喃溶液將亞磷酰轉(zhuǎn)化為磷酸三酯，得到穩(wěn)定的寡核苷酸。
經(jīng)過以上五個(gè)步驟后，一個(gè)脫氧核苷酸就被連到CPG的核苷酸上，同樣再用三氯乙酸脫去新連上的脫氧核苷酸5'-羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT后，重復(fù)以上的活化、連接、封閉、氧化過程即可得到DNA片段粗品。最后對(duì)其進(jìn)行切割、脫保護(hù)基，合成的Oligo在脫去保護(hù)基后，目的Oligo純度是比較低的，其中含有大量的雜質(zhì)。主要雜質(zhì)有：所脫下的保護(hù)基與氨形成的苯甲酸氨和異丁酸氨，腈磷基上脫下的腈乙基，以及合成時(shí)產(chǎn)生的短鏈等。以至于粗產(chǎn)品中全長(zhǎng)Oligo DNA含量?jī)H為25%左右。盡管合成時(shí)每一步的效率都在98%～99%，但累積的效率并不高。這些雜質(zhì)成分，尤其是存在于粗產(chǎn)品中的大量鹽和短鏈，不但造成定量不準(zhǔn)，還會(huì)影響下一步的反應(yīng)。因此必須對(duì)Oligo DNA進(jìn)行純化、定量等合成后處理即可得到符合實(shí)驗(yàn)要求的寡核苷酸片段。