RNA提�。═rizol 法）操作步驟詳解
用Trizol 溶液提取，將總RNA與 DNA 和蛋白質(zhì)分離。Trizol 是一種酸性溶液，含有硫氰酸胍 (GITC)、苯酚和氯仿。GITC 不可逆地使蛋白質(zhì)和 RNase 變性。隨后進行離心。在酸性條件下，總 RNA 保留在上層水相中，而大部分 DNA 和蛋白質(zhì)保留在中間相或下層有機相中。然后通過用異丙醇沉淀回收總 RNA。
RNA提取操作步驟：
準(zhǔn)備試劑：氯仿（避光，提前預(yù)冷）、異丙醇（避光，提前預(yù)冷）、RNase-Free ddH2O 、75%乙醇（使用RNase-Free ddH2O 配制，提前預(yù)冷）。
準(zhǔn)備儀器：離心機（提前打開，4℃預(yù)冷），研磨儀（組織會用到，提前打開，-30°預(yù)冷）
1. 樣品處理
a. 植物組織：以葉片RNA提取為例。取新鮮葉片在液氮中充分研磨或?qū)⑷~片剪碎后直接 在TRNzol試劑中研磨，研磨要迅速，最好不要超過1 min。大約100 mg葉片使用1 ml TRNzol試劑。
b. 動物組織：以豬肝臟RNA提取為例。取新鮮或-70℃凍存組織，每30-50 mg組織（我們一般用50mg，但不一定很精確，可能多也可能少）加入 1 ml TRNzol試劑，用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積一般不要超過TRNzol試劑體積的10%。
c. 單層培養(yǎng)細(xì)胞：單層貼壁細(xì)胞的收集（收集細(xì)胞數(shù)量請不要超過1×107 ）：可直接在培養(yǎng)容器中裂解（容器體積不超過10 cm2 ）,或者使用胰蛋白酶處理后離心收集細(xì)胞沉淀。（在搖瓶中培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞通常采用胰蛋白酶處理的方法）。
1) 直接裂解法： 直接在培養(yǎng)板中加入TRNzol試劑裂解細(xì)胞，每10 cm2 面積加入1 ml TRNzol試劑。用取樣器吹打幾次。
注意：TRNzol試劑加量根據(jù)培養(yǎng)板面積決定，不是由細(xì)胞數(shù)決定。如果TRNzol試劑加量不足，可能導(dǎo)致提取的RNA中有DNA污染。
2) 胰蛋白酶處理法：確定細(xì)胞數(shù)量，吸除培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞，吸除PBS，向細(xì)胞中加入含有0.1-0.25%胰蛋白酶的PBS處理細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞脫離容器壁時，加入含有血清的培養(yǎng)基失活胰蛋白酶，將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至RNase-free的離心管中，300×g離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，仔細(xì)吸除所有上清。
注意：收集細(xì)胞時一定要將細(xì)胞培養(yǎng)液去除干凈，否則會導(dǎo)致裂解不完全，造成RNA的產(chǎn)量降低。
d. 細(xì)胞懸液：離心取細(xì)胞。每5×106 ~1×107 動物細(xì)胞和植物細(xì)胞加入1 ml TRNzol試劑。加入TRNzol試劑前不要洗滌細(xì)胞，以免降解mRNA。
2. 將勻漿樣品在室溫放置5 min，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。
3. 可選步驟：4℃ 12,000 rpm(~13,400×g) 離心10 min，取上清。 （一般我們提細(xì)胞或者大部分組織的RNA時不考慮這一步驟）
注意：如果樣品中含有較多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物結(jié)節(jié)部分等，可離心去除。 離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組 織樣品時，上層是大量油脂，應(yīng)除去。取澄清的勻漿溶液進行下一步操作。
4. 每使用1 ml TRNzol試劑加200ul氯仿（有機溶劑，不溶于水，RNA為離子化合物，溶于水相），蓋好管蓋，劇烈振蕩15 s，室溫放置 3 min。
注意：如不能旋渦混勻，可手動快速顛倒混勻2 min。
5. 4℃ 12,000 rpm離心15 min。樣品會分成三層：粉色的有機相，中間層和上層無色的水相，RNA主要在水相中，把水相（約500 μl，但是我們一般都會取400ul，以免不小心吸到中間層，造成蛋白質(zhì)污染）轉(zhuǎn)移到新的離心管中。
6. 在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇（能奪取RNA周圍的水分，使得RNA能夠聚集而發(fā)生沉淀），混勻，室溫放置10 min。
7. 4℃ 12,000 rpm離心10 min，去上清。離心前RNA沉淀經(jīng)常是看不見的，離心后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀。
8. 加入1ml 75%乙醇（用RNase-free ddH2O配制，可以溶解RNA沉淀中的有機物雜質(zhì)，可溶解一部分蛋白質(zhì)）洗滌沉淀。每使用1 ml TRNzol試劑至少用1ml 75%乙醇對沉淀進行洗滌。
9. 4℃ 10,000 rpm 離心5 min。倒出液體，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液體短暫離心，然后用槍頭吸出，注意不要吸棄沉淀。
10. 室溫放置晾干（不要晾的過干，RNA完全干燥后會很難溶解，大約晾干2-3 min左右即可），根據(jù)實驗需要，加入30-100 μl RNase-Free ddH2O，反復(fù)吹打、混勻，充分溶解RNA。（一般組織RNA濃度會高一些，所以我們組織會加50ul左右的無酶水；細(xì)胞的RNA濃度會低些，我們會加10~20ul左右的無酶水）。
RNA提取操作步驟：
準(zhǔn)備試劑：氯仿（避光，提前預(yù)冷）、異丙醇（避光，提前預(yù)冷）、RNase-Free ddH2O 、75%乙醇（使用RNase-Free ddH2O 配制，提前預(yù)冷）。
準(zhǔn)備儀器：離心機（提前打開，4℃預(yù)冷），研磨儀（組織會用到，提前打開，-30°預(yù)冷）
1. 樣品處理
a. 植物組織：以葉片RNA提取為例。取新鮮葉片在液氮中充分研磨或?qū)⑷~片剪碎后直接 在TRNzol試劑中研磨，研磨要迅速，最好不要超過1 min。大約100 mg葉片使用1 ml TRNzol試劑。
b. 動物組織：以豬肝臟RNA提取為例。取新鮮或-70℃凍存組織，每30-50 mg組織（我們一般用50mg，但不一定很精確，可能多也可能少）加入 1 ml TRNzol試劑，用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積一般不要超過TRNzol試劑體積的10%。
c. 單層培養(yǎng)細(xì)胞：單層貼壁細(xì)胞的收集（收集細(xì)胞數(shù)量請不要超過1×107 ）：可直接在培養(yǎng)容器中裂解（容器體積不超過10 cm2 ）,或者使用胰蛋白酶處理后離心收集細(xì)胞沉淀。（在搖瓶中培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞通常采用胰蛋白酶處理的方法）。
1) 直接裂解法： 直接在培養(yǎng)板中加入TRNzol試劑裂解細(xì)胞，每10 cm2 面積加入1 ml TRNzol試劑。用取樣器吹打幾次。
注意：TRNzol試劑加量根據(jù)培養(yǎng)板面積決定，不是由細(xì)胞數(shù)決定。如果TRNzol試劑加量不足，可能導(dǎo)致提取的RNA中有DNA污染。
2) 胰蛋白酶處理法：確定細(xì)胞數(shù)量，吸除培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞，吸除PBS，向細(xì)胞中加入含有0.1-0.25%胰蛋白酶的PBS處理細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞脫離容器壁時，加入含有血清的培養(yǎng)基失活胰蛋白酶，將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至RNase-free的離心管中，300×g離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，仔細(xì)吸除所有上清。
注意：收集細(xì)胞時一定要將細(xì)胞培養(yǎng)液去除干凈，否則會導(dǎo)致裂解不完全，造成RNA的產(chǎn)量降低。
d. 細(xì)胞懸液：離心取細(xì)胞。每5×106 ~1×107 動物細(xì)胞和植物細(xì)胞加入1 ml TRNzol試劑。加入TRNzol試劑前不要洗滌細(xì)胞，以免降解mRNA。
2. 將勻漿樣品在室溫放置5 min，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。
3. 可選步驟：4℃ 12,000 rpm(~13,400×g) 離心10 min，取上清。 （一般我們提細(xì)胞或者大部分組織的RNA時不考慮這一步驟）
注意：如果樣品中含有較多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物結(jié)節(jié)部分等，可離心去除。 離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組 織樣品時，上層是大量油脂，應(yīng)除去。取澄清的勻漿溶液進行下一步操作。
4. 每使用1 ml TRNzol試劑加200ul氯仿（有機溶劑，不溶于水，RNA為離子化合物，溶于水相），蓋好管蓋，劇烈振蕩15 s，室溫放置 3 min。
注意：如不能旋渦混勻，可手動快速顛倒混勻2 min。
5. 4℃ 12,000 rpm離心15 min。樣品會分成三層：粉色的有機相，中間層和上層無色的水相，RNA主要在水相中，把水相（約500 μl，但是我們一般都會取400ul，以免不小心吸到中間層，造成蛋白質(zhì)污染）轉(zhuǎn)移到新的離心管中。
6. 在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇（能奪取RNA周圍的水分，使得RNA能夠聚集而發(fā)生沉淀），混勻，室溫放置10 min。
7. 4℃ 12,000 rpm離心10 min，去上清。離心前RNA沉淀經(jīng)常是看不見的，離心后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀。
8. 加入1ml 75%乙醇（用RNase-free ddH2O配制，可以溶解RNA沉淀中的有機物雜質(zhì)，可溶解一部分蛋白質(zhì)）洗滌沉淀。每使用1 ml TRNzol試劑至少用1ml 75%乙醇對沉淀進行洗滌。
9. 4℃ 10,000 rpm 離心5 min。倒出液體，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液體短暫離心，然后用槍頭吸出，注意不要吸棄沉淀。
10. 室溫放置晾干（不要晾的過干，RNA完全干燥后會很難溶解，大約晾干2-3 min左右即可），根據(jù)實驗需要，加入30-100 μl RNase-Free ddH2O，反復(fù)吹打、混勻，充分溶解RNA。（一般組織RNA濃度會高一些，所以我們組織會加50ul左右的無酶水；細(xì)胞的RNA濃度會低些，我們會加10~20ul左右的無酶水）。
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