譜系示蹤的難點(diǎn)之基因標(biāo)記的異位表達(dá)如何避免？（上）

通常，細(xì)胞類型中基因的激活不是“有”或“無”，特定的基因標(biāo)記意味著啟動(dòng)子的活性在這種細(xì)胞類型中相對(duì)較高，而在其他細(xì)胞中，目的啟動(dòng)子也可能被弱激活，這種現(xiàn)象也被叫做異位表達(dá)。異位表達(dá)對(duì)譜系追蹤的影響很大，常常會(huì)導(dǎo)致一些關(guān)于細(xì)胞命運(yùn)的爭(zhēng)議。
 

圖.異位表達(dá)對(duì)譜系示蹤的影響^[1]

上一期，我們講述了雙重組酶介導(dǎo)的交叉報(bào)告基因類型，這種類型常用于標(biāo)記雙陽性的細(xì)胞類型，而本次課程，我們來講述可以用于避免基因標(biāo)記異位表達(dá)的獨(dú)家報(bào)告基因系統(tǒng)。

譜系示蹤系類課程往期回顧：
【譜系示蹤系列第一期】基礎(chǔ)細(xì)胞標(biāo)記方式
【譜系示蹤系列第二期】單重組酶介導(dǎo)的多色報(bào)告系統(tǒng)方法
【譜系示蹤系列第三期】多重組酶介導(dǎo)的交叉報(bào)告基因方法

獨(dú)家報(bào)告基因系統(tǒng)

獨(dú)家報(bào)告基因系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)是 Promoter-site1-site2-Stop-site1-reporter A-Stop-site2-reporter B。這類系統(tǒng)是利用兩個(gè)重組系統(tǒng)，將兩對(duì)識(shí)別位點(diǎn)錯(cuò)落的分布在兩個(gè)報(bào)告基因兩端。如果首先發(fā)生一個(gè)重組，則相應(yīng)報(bào)告基因的表達(dá)將去除另一個(gè)重組系統(tǒng)的一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。換句話說，這個(gè)系統(tǒng)會(huì)防止同一細(xì)胞中發(fā)生二次重組。

獨(dú)家報(bào)告基因小鼠的基因重組，存在先后順序，可能會(huì)出現(xiàn)以下兩種情況：

情況一
A-Cre 先表達(dá)，B-DreERT2 后續(xù)通過 Tamoxifen 誘導(dǎo)表達(dá)。
 

當(dāng)A-cre先表達(dá)時(shí)：

1 A⁺細(xì)胞：
makerA 介導(dǎo) Cre 酶表達(dá)，Cre 酶會(huì)切除兩個(gè) loxP 位點(diǎn)之間的序列（第一個(gè) stop 序列與第一個(gè) Rox 位點(diǎn)被切除）。該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，表達(dá)綠色熒光 ZsGreen。

2 A^- 細(xì)胞：
該系統(tǒng)未發(fā)生重組，按照啟動(dòng)子的方向，遇到第一個(gè) stop 序列被終止表達(dá)，細(xì)胞未被染色。

之后，使用 Tamoxifen 誘導(dǎo) B-DreERT2 時(shí)：

1 A⁺ 細(xì)胞：
由于該系統(tǒng)中的第一個(gè) Rox 位點(diǎn)被切除，無論細(xì)胞是否表達(dá)makerB，該系統(tǒng)均只表達(dá)綠色熒光 ZsGreen。

2 A^-B⁺ 細(xì)胞：
makerB 介導(dǎo) Dre 酶表達(dá)，Dre 酶會(huì)切除兩個(gè) Rox 位點(diǎn)之間的序列（綠色熒光 ZsGreen、第二個(gè) Loxp 位點(diǎn)與第二個(gè) stop 序列被切除），之后，該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，表達(dá)紅色熒光 tdTomato。

3 A^-B^- 細(xì)胞：
該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，遇到 stop 序列被終止表達(dá)，細(xì)胞未被染色。

因此，A⁺細(xì)胞可被標(biāo)記為綠色。A^-B⁺細(xì)胞可被標(biāo)記為紅色。

情況二
B-Dre 先表達(dá)，A-CreERT2 后續(xù)通過 Tamoxifen 誘導(dǎo)表達(dá)。

當(dāng)B-Dre先表達(dá)時(shí)：
1 B⁺細(xì)胞：
makerB 介導(dǎo) Dre 酶表達(dá)，Dre 酶會(huì)切除兩個(gè) Rox 位點(diǎn)之間的序列（綠色熒光 ZsGreen、第二個(gè) Loxp 位點(diǎn)與第二個(gè) stop 序列被切除）。該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，表達(dá)紅色熒光 tdTomato。

2 B^- 細(xì)胞：
該系統(tǒng)未發(fā)生重組，按照啟動(dòng)子的方向，遇到第一個(gè) stop 序列被終止表達(dá)，細(xì)胞未被染色。

之后，使用 Tamoxifen 誘導(dǎo) B-DreERT2 時(shí)：

1 B⁺ 細(xì)胞：
由于該系統(tǒng)中的第一個(gè) Loxp 位點(diǎn)被切除，無論細(xì)胞是否表達(dá)makerA，該系統(tǒng)均只表達(dá)紅色熒光 tdTomato。

2 A⁺B^- 細(xì)胞：
makerA 介導(dǎo) Cre 酶表達(dá)，Cre 酶會(huì)切除兩個(gè) loxP 位點(diǎn)之間的序列（第一個(gè) stop 序列與第一個(gè) Rox 位點(diǎn)被切除）。該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，表達(dá)綠色熒光 ZsGreen。

3 A^-B^- 細(xì)胞：
該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，遇到 stop 序列被終止表達(dá)，細(xì)胞未被染色。

因此，B⁺細(xì)胞可被標(biāo)記為紅色。A⁺B^-細(xì)胞可被標(biāo)記為綠色。

我們使用獨(dú)家報(bào)告基因小鼠，如何避免基因標(biāo)記的異位表達(dá)呢？顯然，獨(dú)家報(bào)告基因小鼠可幫助您標(biāo)記 A⁺B^-（反之亦然）的細(xì)胞類型，因此，若我們想標(biāo)記 MarkerA 的細(xì)胞，但 A 基因出現(xiàn)了異位表達(dá)，那我們可以利用在非目的細(xì)胞中特異性表達(dá)的 MarkerB，使用獨(dú)家報(bào)告基因系統(tǒng)將其標(biāo)記為其他顏色，從而排除 MarkerA 異位表達(dá)的影響。

案例1
以 c-kit 基因?yàn)槔�，既往研究�?bào)道 c-kit+細(xì)胞是心肌細(xì)胞祖細(xì)胞（ECs），可能有助于心臟損傷后的新心肌細(xì)胞生成。然而，隨后的研究表明，c-kit基因也在極少數(shù)心肌細(xì)胞中表達(dá)，表明心臟損傷后追蹤的心肌細(xì)胞可能是先前標(biāo)記的c-kit+心肌細(xì)胞。

但我們需要特異性靶向的c-kit+非心肌細(xì)胞，追蹤其分化命運(yùn)，才能得出正確的結(jié)論。因此，我們可以使用心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記工具Tnni3-Dre將心肌細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，之后再對(duì)c-kit+細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，此時(shí)標(biāo)記的細(xì)胞即為c-kit+非心肌細(xì)胞。

圖.獨(dú)家報(bào)告基因系統(tǒng)^[2]
 

圖.使用普通方法標(biāo)記C-Kit⁺細(xì)胞無法準(zhǔn)確標(biāo)記ECs^[2]
 

點(diǎn)擊下圖，觀看標(biāo)記圖示

圖.使用獨(dú)家報(bào)告基因系統(tǒng)先將心肌細(xì)胞標(biāo)記為紅色，后將ECs標(biāo)記為綠色^[2]

上述講述的是多重組酶報(bào)告基因系統(tǒng)的獨(dú)家報(bào)告基因類型，主要用于標(biāo)記 A⁺B^-（反之亦然）的細(xì)胞類型，這種標(biāo)記存在先后順序，相反的先后順序會(huì)極大的影響后續(xù)的標(biāo)記結(jié)果。為了更加合理的控制標(biāo)記細(xì)胞類型，建議兩個(gè)重組酶中一種采用可誘導(dǎo)類型的重組酶，從而合理控制重組發(fā)生的先后順序。

但如果您想標(biāo)記的細(xì)胞類型，他在胚胎發(fā)育期 markerA 表達(dá)，但在成年后 markerA 不表達(dá)，并且表達(dá)markerB。若我們采用獨(dú)家報(bào)告基因系統(tǒng)，使用A-Cre與B-DreERT2，目的細(xì)胞仍無法成功標(biāo)記。

是否存在可以使用兩個(gè)重組酶均是可誘導(dǎo)型的（可控制重組發(fā)生的時(shí)間），并且兩者之間的重組不會(huì)相互干擾，而且還可以成功標(biāo)記 A⁺B^- 的細(xì)胞類型的報(bào)告工具鼠呢？

下一期鼠博士為大家講解多重組酶報(bào)告基因系統(tǒng)的嵌套報(bào)告基因類型。

Reference：
[1] He L, Li Y, Li Y, Pu W, Huang X, Tian X, Wang Y, Zhang H, Liu Q, Zhang L, Zhao H, Tang J, Ji H, Cai D, Han Z, Han Z, Nie Y, Hu S, Wang QD, Sun R, Fei J, Wang F, Chen T, Yan Y, Huang H, Pu WT, Zhou B. Enhancing the precision of genetic lineage tracing using dual recombinases. Nat Med. 2017 Dec;23(12):1488-1498. doi: 10.1038/nm.4437. Epub 2017 Nov 13. PMID: 29131159; PMCID: PMC6913096.

[2] Liu K, Jin H, Zhou B. Genetic lineage tracing with multiple DNA recombinases: A user's guide for conducting more precise cell fate mapping studies. J Biol Chem. 2020 May 8;295(19):6413-6424. doi: 10.1074/jbc.REV120.011631. Epub 2020 Mar 25. PMID: 32213599; PMCID: PMC7212637.

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