Cell文獻(xiàn)解讀:小鼠模型在發(fā)現(xiàn)軟骨再生新機(jī)制中的應(yīng)用,助力關(guān)節(jié)炎治療

2025年7月21日，同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院、附屬東方醫(yī)院岳銳教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合海南醫(yī)科大學(xué)鄒衛(wèi)國(guó)教授團(tuán)隊(duì)在國(guó)際頂級(jí)學(xué)術(shù)期刊《Cell》在線發(fā)表了題為“Procr⁺ chondroprogenitors sense mechanical stimuli to govern articular cartilage maintenance and regeneration”的研究論文。該研究首次發(fā)現(xiàn)了對(duì)力學(xué)刺激敏感的Procr⁺軟骨干細(xì)胞，并證明其不僅對(duì)關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)維持至關(guān)重要，而且在關(guān)節(jié)損傷后能顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞再生，提示其有望成為治療骨性關(guān)節(jié)炎等退行性骨關(guān)節(jié)病的新一代種子細(xì)胞。

南模生物為該研究提供了M-NSG（目錄號(hào)：NM-NSG-001）小鼠。

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種高發(fā)的退行性關(guān)節(jié)病，全球患者已逾2.4億，其患病率與年齡高度相關(guān)：60歲以上人群中，男性達(dá)10%，女性更高達(dá)18%。該疾病以關(guān)節(jié)間隙狹窄、軟骨磨損、軟骨下骨硬化、滑膜炎、持續(xù)疼痛、關(guān)節(jié)變形及活動(dòng)障礙為主要表現(xiàn)，晚期可致嚴(yán)重殘疾�，F(xiàn)有療法（如口服非甾體抗炎藥）僅能暫時(shí)緩解疼痛和炎癥，無(wú)法逆轉(zhuǎn)軟骨破壞，但嚴(yán)重病例可能需要進(jìn)行全關(guān)節(jié)置換手術(shù)。

基質(zhì)相關(guān)自體軟骨細(xì)胞植入術(shù)（matrix-associated autologous chondrocyte implantation，MACI）是一種利用患者自體軟骨細(xì)胞培養(yǎng)修復(fù)軟骨缺損的治療方法，目前已獲美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)，可用于修復(fù)18~55歲患者的孤立性關(guān)節(jié)軟骨損傷。然而，自體軟骨細(xì)胞增殖能力有限，導(dǎo)致MACI術(shù)后康復(fù)周期延長(zhǎng)且可修復(fù)區(qū)域受到限制。

成人膝關(guān)節(jié)內(nèi)，究竟哪種細(xì)胞才是關(guān)節(jié)軟骨祖細(xì)胞？以及這些細(xì)胞如何調(diào)控軟骨再生？這些問(wèn)題都尚未可知。

為明確這些問(wèn)題，作者進(jìn)行了以下研究：

1 Procr⁺細(xì)胞優(yōu)先定位于脛骨關(guān)節(jié)軟骨和半月板的淺層
Procr蛋白被認(rèn)為是髓核祖細(xì)胞的標(biāo)志物，然而，它是否標(biāo)記其他骨骼部位的祖細(xì)胞仍不明確。為驗(yàn)證Procr⁺細(xì)胞是否存在于成人長(zhǎng)骨中，作者選用 Procr-CreERT2;tdTomato 小鼠進(jìn)行譜系示蹤：他莫昔芬誘導(dǎo)后，4周齡小鼠脛骨關(guān)節(jié)軟骨和半月板表層均出現(xiàn) tdTomato⁺信號(hào)（圖1A），股骨關(guān)節(jié)軟骨亦可見零星陽(yáng)性細(xì)胞；且隨年齡增長(zhǎng)，脛骨與半月板內(nèi)的 tdTomato⁺細(xì)胞數(shù)量遞減，提示 Procr⁺細(xì)胞在青春期更為豐富（圖1B，1C）。
 

Fig1. Procr⁺表層細(xì)胞在出生后膝關(guān)節(jié)中生成關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和半月板軟骨細(xì)胞

2 Procr⁺淺表細(xì)胞是軟骨祖細(xì)胞，可生成關(guān)節(jié)和半月板軟骨細(xì)胞
為追蹤 Procr⁺淺表細(xì)胞在出生后膝關(guān)節(jié)發(fā)育中的命運(yùn)，作者在4周齡Procr-CreERT2; tdTomato小鼠中給予他莫昔芬，并在1~2個(gè)月后分析其細(xì)胞命運(yùn)。結(jié)果表明，除淺表層外，脛骨關(guān)節(jié)軟骨和半月板中/深層區(qū)的tdTomato⁺細(xì)胞數(shù)量逐漸增加（圖1D-1G）。提示Procr⁺細(xì)胞能夠進(jìn)一步分化產(chǎn)生中層/深層關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。為排除骨骼來(lái)源細(xì)胞生成關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的可能性，作者利用IR1報(bào)告小鼠進(jìn)行雙重重組酶譜系示蹤（圖1H）。結(jié)果顯示，在Acan-Dre; Procr-CreERT2; IR1小鼠中，關(guān)節(jié)軟骨和半月板中均未檢測(cè)到 ZsGreen⁺細(xì)胞（圖1I，1J），提示非骨骼來(lái)源的 Procr⁺細(xì)胞（如內(nèi)皮或造血干細(xì)胞）不參與出生后膝關(guān)節(jié)軟骨形成。

3 機(jī)械刺激調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨和半月板中Procr+細(xì)胞的分布和頻率
鑒于脛骨平臺(tái)比股骨遠(yuǎn)端承受更大的機(jī)械負(fù)荷，Procr⁺細(xì)胞在脛骨中的優(yōu)先分布提示其可能是對(duì)機(jī)械刺激敏感的淺表細(xì)胞亞群。為驗(yàn)證這一假設(shè)，作者對(duì)4周齡Procr-CreERT2; tdTomato小鼠進(jìn)行為期4周的強(qiáng)制跑步（每天1h，圖2A）。結(jié)果顯示，跑步組小鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨骨量、骨小梁數(shù)量及厚度顯著增加，骨小梁間距減小，皮質(zhì)骨面積、厚度及極慣性矩亦顯著增加。為分析跑步對(duì)Procr⁺淺表細(xì)胞的影響，作者在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)給予他莫昔芬，并于2天后分析其分布和數(shù)量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，機(jī)械刺激顯著增加了脛骨和半月板及股骨中的Procr⁺細(xì)胞數(shù)量（圖2B-2F）。

隨后，作者對(duì)4周齡Procr-CreERT2; tdTomato小鼠進(jìn)行為期4周的尾部懸吊以模擬機(jī)械卸載（圖2G）。結(jié)果顯示，懸吊組小鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨骨量、骨小梁數(shù)量顯著減少，骨小梁間距增加，皮質(zhì)骨厚度及極慣性矩亦顯著降低。與跑步實(shí)驗(yàn)相反，尾部懸吊顯著減少了脛骨和半月板中的Procr⁺細(xì)胞數(shù)量，而股骨中 Procr⁺細(xì)胞數(shù)量極少（圖2H，2L）。以上結(jié)果提示，機(jī)械刺激對(duì)關(guān)節(jié)軟骨和半月板中Procr⁺細(xì)胞的分布和數(shù)量起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。
 

Fig2. 生理?xiàng)l件下 Procr⁺表層細(xì)胞對(duì)機(jī)械刺激敏感

4 骨關(guān)節(jié)炎激活Procr⁺軟骨祖細(xì)胞以促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)
骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）會(huì)顯著改變膝關(guān)節(jié)的機(jī)械負(fù)荷。為驗(yàn)證OA是否調(diào)控Procr⁺細(xì)胞的激活與分化，作者在8周齡Procr-CreERT2; tdTomato小鼠中連續(xù)5天給予他莫昔芬，2天后通過(guò)內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)術(shù)（DMM）建立OA模型（圖3A）。結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，DMM組脛骨、股骨及半月板中/深層區(qū)的 tdTomato⁺軟骨細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖 3C，3E-3H），提示 Procr⁺細(xì)胞在關(guān)節(jié)軟骨損傷后被激活并分化為下游軟骨細(xì)胞。

為驗(yàn)證 Procr⁺細(xì)胞是否對(duì) OA 進(jìn)展起保護(hù)作用，作者構(gòu)建了Procr-CreERT2; tdTomato; DTA小鼠，通過(guò)給予他莫昔芬誘導(dǎo)白喉毒素表達(dá)以特異性清除Procr⁺細(xì)胞（圖3B）。8周齡小鼠連續(xù)5天給予他莫昔芬，2天后行DMM手術(shù)。結(jié)果顯示，在Procr⁺細(xì)胞被特異性消融的小鼠中，OA相關(guān)指標(biāo)OARSI評(píng)分升高（圖3I，3J）、骨贅形成增多（圖3K，3L）。以上結(jié)果提示，OA激活Procr⁺軟骨祖細(xì)胞以促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)。
 

Fig3. OA激活 Procr⁺軟骨干細(xì)胞以促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)

5 Piezo1介導(dǎo)Procr⁺軟骨祖細(xì)胞在OA進(jìn)展中的機(jī)械感應(yīng)
為進(jìn)一步揭示Procr⁺軟骨祖細(xì)胞在OA進(jìn)展中感應(yīng)機(jī)械刺激的分子機(jī)制，作者對(duì)DMM模型小鼠的關(guān)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序（圖4A）。結(jié)果顯示，Procr⁺細(xì)胞中機(jī)械敏感基因Piezo1高表達(dá)，且Klf2調(diào)控的軟骨分化相關(guān)通路激活。為驗(yàn)證Piezo1是否介導(dǎo)Procr⁺軟骨祖細(xì)胞的機(jī)械感應(yīng)，作者進(jìn)行了下一步實(shí)驗(yàn)。他們向DMM誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎后的 Procr-CreERT2; tdTomato小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)，每周注射Piezo/TRPV通道非特異性抑制劑 GsMTx4。結(jié)果顯示，GsMTx4顯著抑制了 DMM 后 tdTomato⁺軟骨細(xì)胞的生成（圖4J, 4K），并加劇了OA癥狀（圖4L, 4M）。以上結(jié)果提示，Piezo1是Procr⁺軟骨祖細(xì)胞感知機(jī)械刺激并修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的關(guān)鍵分子。
 

Fig4. Piezo1信號(hào)在OA進(jìn)展中介導(dǎo)Procr⁺軟骨干細(xì)胞的機(jī)械感知

6 基因敲除Piezo1損害Procr⁺細(xì)胞激活及關(guān)節(jié)軟骨再生
為排除GsMTx4脫靶效應(yīng)，作者構(gòu)建了Procr特異性敲除Piezo1的小鼠模型（Procr-CreERT2; tdTomato; Piezo1^fl/fl），DMM術(shù)后結(jié)果顯示，cKO小鼠tdTomato⁺軟骨細(xì)胞數(shù)量顯著低于對(duì)照組（圖5A，5B），OARSI評(píng)分及軟骨下骨厚度顯著增加（圖5C-5F），骨贅形成及半月板鈣化加劇（圖5G，5H）。

為驗(yàn)證Piezo1在生理?xiàng)l件下是否調(diào)控 Procr⁺細(xì)胞，作者在4周齡cKO及對(duì)照小鼠中給予他莫昔芬，隨后進(jìn)行4周強(qiáng)制跑步。結(jié)果與DMM模型一致，Piezo1缺失顯著抑制跑步誘導(dǎo)的tdTomato⁺軟骨細(xì)胞生成（圖 5I-5K）。綜上，Piezo1 在生理及病理?xiàng)l件下均為 Procr⁺細(xì)胞激活及關(guān)節(jié)軟骨再生所必需。
 

Fig5. Piezo1基因缺失損害Procr⁺細(xì)胞的激活和關(guān)節(jié)軟骨再生

7 藥理性激活Piezo1可緩解OA癥狀
為驗(yàn)證Piezo1信號(hào)激活是否具有治療潛力，作者對(duì)8周齡野生型小鼠進(jìn)行了DMM手術(shù)，并每周在關(guān)節(jié)腔注射Piezo1激動(dòng)劑Yoda1，8周后評(píng)估OA表型。結(jié)果顯示，Yoda1以劑量依賴性方式顯著降低OARSI評(píng)分（圖6A，6B），并減少軟骨下骨厚度（圖6C，6D）。Micro-CT亦顯示360 μM Yoda1顯著抑制骨贅形成（圖6E，6F），但對(duì)半月板鈣化體積無(wú)顯著影響（圖6G，6H）。以上結(jié)果提示，關(guān)節(jié)腔內(nèi)給予Piezo1激動(dòng)劑可顯著改善OA癥狀。
 

Fig6. 藥物激活Piezo1可緩解OA癥狀

8 Procr⁺細(xì)胞原位移植促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)
為驗(yàn)證Procr⁺細(xì)胞能否是否可以促進(jìn)軟骨的原位再生，作者進(jìn)行了原位移植來(lái)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損。作者通過(guò)流式分選了mTmG小鼠Procr⁺CD105⁺CD200⁺或 Procr⁻細(xì)胞，經(jīng)2D擴(kuò)增、3D球體培養(yǎng)后植入缺損區(qū)（圖7J）。結(jié)果顯示，Procr⁺細(xì)胞組缺損區(qū)出現(xiàn)大量軟骨樣組織，Safranin O染色陽(yáng)性，而Procr⁻組僅見纖維樣組織（圖7K，7L）。mTmG來(lái)源細(xì)胞的tdTomato熒光證實(shí)再生的軟骨來(lái)自供體細(xì)胞（圖7K）。

為評(píng)估人源PROCR⁺細(xì)胞的轉(zhuǎn)化潛力，作者從29~86歲志愿受試者關(guān)節(jié)軟骨中分選出PROCR⁺細(xì)胞，經(jīng)2D擴(kuò)增、3D球體培養(yǎng)后，植入8周齡M-NSG免疫缺陷小鼠關(guān)節(jié)軟骨缺損處（由南模生物提供）。與未分選細(xì)胞相比，年輕及老年供體的PROCR⁺細(xì)胞均顯著促進(jìn)軟骨再生（圖7N-7Q）。人源特異性LAMIN A/C免疫熒光證實(shí)再生軟骨為人源（圖 7N，7P，S6F）。以上結(jié)果提示，PROCR⁺細(xì)胞可作為治療關(guān)節(jié)疾病的理想軟骨祖細(xì)胞來(lái)源，或許有望突破當(dāng)前MACI技術(shù)在年齡限制上的瓶頸。
 

Fig7. Procr⁺表層細(xì)胞具有干細(xì)胞活性，移植后可高效修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損

綜上所述，該研究工作在小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨和半月板淺表層中發(fā)現(xiàn)了對(duì)機(jī)械力刺激敏感的Procr⁺軟骨祖細(xì)胞，并證明其在出生后關(guān)節(jié)穩(wěn)態(tài)維持和損傷修復(fù)過(guò)程中能夠通過(guò)Piezo1感受機(jī)械力刺激，從而密切調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分化與再生。此外，研究還發(fā)現(xiàn)了人類PROCR⁺細(xì)胞可以用于細(xì)胞治療高效再生關(guān)節(jié)軟骨。
 

圖8. 研究模式圖

南模生物擁有經(jīng)驗(yàn)豐富的模型定制團(tuán)隊(duì)，可為客戶定制敲除、條件性敲除、點(diǎn)突變、人源化、敲入等多種類型的基因編輯小鼠。此外，南模生物擁有含上萬(wàn)種成品小鼠的模型資源庫(kù)，基本覆蓋熱門基因的敲除/條件性敲除小鼠、免疫缺陷小鼠、靶點(diǎn)人源化小鼠、自發(fā)疾病小鼠、Cre/Dre 工具鼠、熒光示蹤小鼠等。

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Reference：
[1] Zhu Q, Yin F, Qin J, et al. Procr⁺ chondroprogenitors sense mechanical stimuli to govern articular cartilage maintenance and regeneration. Cell. Published online July 17, 2025. doi:10.1016/j.cell.2025.06.036

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