規(guī)避ELISA試驗(yàn)操作對結(jié)果的影響方法

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)具有靈敏度高、特異性好、操作簡便、技術(shù)可靠、試劑穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于傳染性疾病、腫瘤標(biāo)志物以及激素等項(xiàng)目的檢測，但在ELISA實(shí)驗(yàn)過程中時(shí)常會出現(xiàn)復(fù)測現(xiàn)象即我們時(shí)常說的"花板"現(xiàn)象，即空白、陰性對照、陽性對照及室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果正常，血液標(biāo)本吸光度(OD)值普遍偏高（或個(gè)別OD值偏高，經(jīng)復(fù)查均為陰性）、弱陽性結(jié)果較多，而大多數(shù)真陽性標(biāo)本出現(xiàn)弱陽性結(jié)果。

這種現(xiàn)象影響檢驗(yàn)結(jié)果的正確判讀，對工作造成一定的不利影響，一旦出現(xiàn)“花板”，實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須放棄，重新進(jìn)行，不僅浪費(fèi)物料和時(shí)間，而且還會出現(xiàn)樣本量缺少、交叉污染、報(bào)告延遲等一系列問題。同時(shí)也給廣大獻(xiàn)血漿的愛心人士在當(dāng)日等候化驗(yàn)結(jié)果中加長等待時(shí)間，嚴(yán)重影響大家奉獻(xiàn)愛心的積極性。為此我們對“花板”現(xiàn)象進(jìn)行了原因分析與總結(jié)，使“花板”降至最低限度，從而提高檢測的特異性，并得到更準(zhǔn)確、更可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。影響因素分析如下：

一、標(biāo)本

正確處理標(biāo)本，防止大規(guī)模溶血、血漿層異物、使用一次性加樣槍頭，防止交叉污染。血清和血漿均可以用于檢測，但血清的分離應(yīng)在抽血后等血液完全凝固后再離心，以防止洗板因纖維蛋白堵塞洗板機(jī)，導(dǎo)致因洗板不充分引起“花板”。同時(shí)，溶血是由于紅細(xì)胞破裂引起的，血細(xì)胞成分血紅蛋白具有過氧化物酶特性，釋放到血漿或血清中，會催化底物而造成假陽性。

二、試劑

正確保存及使用有效試劑。使用過期試劑及底物接觸金屬容器、底物混合后放置時(shí)間較長均影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。選擇試劑時(shí)應(yīng)選擇靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性好，批間差小的試劑。不同廠家的試劑不能混用，包括底物和洗滌液。檢測前應(yīng)將試劑放置室溫平衡半小時(shí)，洗滌液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，同時(shí)觀察濃縮洗滌液中有無結(jié)晶，若有結(jié)晶應(yīng)放37℃水浴中融化后才可使用。

三、技術(shù)人員操作

嚴(yán)格按照相關(guān)實(shí)驗(yàn)SOP操作實(shí)驗(yàn)。加樣量的準(zhǔn)確與否，直接影響抗原抗體結(jié)合物的濃度，直至最后顯色的深淺。加樣時(shí)應(yīng)盡可能的垂直加樣，并加在包被孔的底部（注：勿應(yīng)用力過度破壞底部包被物質(zhì)），不可加在孔的上部及外部。實(shí)際工作中我們會發(fā)現(xiàn)，用加樣槍加酶和底物時(shí)，速度過快，有時(shí)會加在兩孔之間，所以操作時(shí)速度應(yīng)適中，不可為了追求速度而不顧質(zhì)量。具體情況因人而異。

四、溫浴

使用水浴箱作為溫浴設(shè)備時(shí)，應(yīng)注意水的深淺對結(jié)果的影響，當(dāng)水浴箱中水的的實(shí)測溫度37℃時(shí)，則水面溫度可能只有34℃，空氣溫度更低，甚至只有二十多度，所以當(dāng)水浴箱中水位過低時(shí)則酶標(biāo)微孔板沒有浸入水中，則反應(yīng)溫度會達(dá)不到37℃，相應(yīng)的就會影響酶促反應(yīng)。為防止邊緣效應(yīng)，酶標(biāo)板應(yīng)盡量浸入水中，以保證受熱的均勻。水浴時(shí)，酶標(biāo)板應(yīng)封好，以免水滴滴入包被孔中，或陽性標(biāo)本的蒸發(fā)。嚴(yán)格掌握溫浴時(shí)間，不可為了早點(diǎn)出結(jié)果擅自縮短溫浴時(shí)間。

五、洗板機(jī)

洗板是ELISA實(shí)驗(yàn)中至關(guān)重要的一步，它決定著試驗(yàn)的成敗。若血清中的纖維蛋白或洗滌液中有結(jié)晶，將堵塞洗板機(jī)針孔，造成全堵或半堵狀態(tài)，以致使未結(jié)合的酶標(biāo)記物不能完全洗脫，而使最后底物顯色時(shí)加深，造成假陽性或“花板”。廢液瓶裝滿后應(yīng)及時(shí)清空，以防止廢液回流對管道的污染，而使洗滌不徹底，造成“花板”。洗板結(jié)束后應(yīng)用蒸餾水徹底清洗管道，以防止廢液在管道中的殘留。同時(shí)應(yīng)根據(jù)儀器維護(hù)保養(yǎng)程序，定期對洗板機(jī)進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)。

六、酶標(biāo)儀

酶標(biāo)儀應(yīng)安置在避光條件下，比色前應(yīng)提前15-30分鐘開機(jī)預(yù)熱，這樣測定結(jié)果會更穩(wěn)定。為防止顯色的加深或減弱，顯色時(shí)間完成后應(yīng)立即滴加終止液（避免氣泡產(chǎn)生），并在10分鐘內(nèi)完成比色。酶標(biāo)板從水浴箱取出后應(yīng)擦凈孔底水滴，若有水滴或紙屑?xì)埩粼诳椎祝瑫�造成酶�?biāo)儀讀數(shù)錯(cuò)誤，誤判定為“花板”。

總之，ELISA試驗(yàn)看似是一項(xiàng)操作簡單的診斷技術(shù)，但其中涉及諸多環(huán)節(jié)，若任意一環(huán)節(jié)操作不當(dāng)，將影響結(jié)果的判斷。即使在最佳條件下，不同廠家的試劑也會做出不同的結(jié)果，因此，對于ELISA試驗(yàn)的結(jié)果解釋，我們只能說檢測到某種抗體或抗原，而不能作為一種確診試驗(yàn)。為了避免“花板”問題的出現(xiàn)，降低檢測的假陽性率，獲得更理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，做出了以上總結(jié)及對策。