Puromycin(嘌呤霉素)的作用機(jī)制及在轉(zhuǎn)染篩選、動(dòng)物造模中的應(yīng)用

Puromycin（嘌呤霉素）是一種由白黑鏈霉菌（Streptomyces alboniger）產(chǎn)生的氨基核苷類(lèi)抗生素，Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）也是一種常用的蛋白質(zhì)合成抑制劑，多用于轉(zhuǎn)染篩選、蛋白翻譯研究、動(dòng)物造模等實(shí)驗(yàn)。AbMole為全球科研客戶提供高純度、高生物活性的抑制劑、細(xì)胞因子、人源單抗、天然產(chǎn)物、熒光染料、多肽、靶點(diǎn)蛋白、化合物庫(kù)、抗生素等科研試劑，全球大量文獻(xiàn)專(zhuān)利引用。

一、Puromycin(嘌呤霉素)的作用機(jī)制

在細(xì)胞內(nèi)，蛋白質(zhì)的合成是一個(gè)極其復(fù)雜且高度有序的過(guò)程，而Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）就如同一個(gè) “搗亂分子”可以干擾這一關(guān)鍵進(jìn)程。它的作用靶點(diǎn)主要是核糖體，通過(guò)模擬氨�；� tRNA（aa-tRNA）的 3' 末端結(jié)構(gòu)，巧妙地混入蛋白質(zhì)合成的 “生產(chǎn)線” 中。正常情況下，氨�；� tRNA 攜帶特定的氨基酸進(jìn)入核糖體的 A 位點(diǎn)，參與肽鏈的延伸。而嘌呤霉素由于其結(jié)構(gòu)與氨酰化tRNA的3'末端極為相似，能夠以假亂真，代替正常的氨基酸進(jìn)入核糖體。一旦PuromycinPuromycin（嘌呤霉素）進(jìn)入核糖體的A位點(diǎn)，核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶中心（PTC）就會(huì)將其催化摻入到新生肽鏈的C末端。然而，嘌呤霉素畢竟不是真正的氨基酸，它無(wú)法像正常的氨�；� tRNA 那樣參與后續(xù)的肽鏈延伸反應(yīng)。這就如同在一條生產(chǎn)線上，突然混入了一個(gè)不符合標(biāo)準(zhǔn)的零件，導(dǎo)致整個(gè)生產(chǎn)流程被迫中斷，翻譯過(guò)程過(guò)早終止[1]。
 

 圖 1. Puromycin的作用機(jī)理[1]

二、應(yīng)用領(lǐng)域
1. 抗性篩選
細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源核酸（如 DNA、RNA 等）導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程�？蒲腥藛T通常可將含有抗嘌呤霉素的基因（如 pac 基因，編碼嘌呤霉素N-酰轉(zhuǎn)移酶）的載體與目的基因重組后轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中。pac可乙�；�Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637），使其失去對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制活性，從而賦予細(xì)胞對(duì)嘌呤霉素的抗性。通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入Puromycin，實(shí)驗(yàn)人員可以通過(guò)篩選獲得成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在具體操作中需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定最佳篩選濃度。2014年，AbMole的兩款抑制劑分別被西班牙國(guó)家心血管研究中心和美國(guó)哥倫比亞大學(xué)用于動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，相關(guān)科研成果發(fā)表于頂刊 Nature 和 Nature Medicine。

2. 蛋白質(zhì)翻譯研究

翻譯水平的調(diào)節(jié)是重要的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制之一，涉及mRNA 翻譯因子、核糖體蛋白、RNA 結(jié)合蛋白和非編碼 RNA 的表達(dá)以及 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)、RNA甲基化和上游開(kāi)放閱讀框選擇的調(diào)節(jié)變化。Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）是一種研究蛋白翻譯的重要工具，當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)體系中以低濃度加入嘌呤霉素時(shí)，它能夠特異性地?fù)饺氲叫潞铣傻碾逆溨�。這一過(guò)程就像是給上述肽鏈貼上了一個(gè)特殊的“標(biāo)簽”，科研人員可以通過(guò)追蹤這個(gè) “標(biāo)簽” 來(lái)了解蛋白質(zhì)合成的動(dòng)態(tài)過(guò)程，通過(guò)可以特異性識(shí)別Puromycin的抗體進(jìn)行免疫印記和免疫熒光等方式檢測(cè)蛋白翻譯的動(dòng)態(tài)過(guò)程。此外，基于嘌呤霉素的檢測(cè)與鄰位連接 （PLA） 檢測(cè)的結(jié)合（Puro-PLA），實(shí)驗(yàn)人員可以檢測(cè)特異性 mRNA 的翻譯。Puro-PLA：目的蛋白抗體和Puromycin的抗體各帶有一段可以互補(bǔ)的核苷酸序列，當(dāng)Puromycin作用于目的肽鏈上時(shí)，與目的蛋白的新生肽鏈間距較近，隨后加入上述兩種抗體，此時(shí)上述的兩段核苷酸就會(huì)互補(bǔ)配對(duì)，隨后通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。

圖 2. Puro-PLA的工作原理

3. 構(gòu)建動(dòng)物腎病模型
Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）在構(gòu)建動(dòng)物模型，尤其是腎病模型方面，有著重要的應(yīng)用。以構(gòu)建腎病動(dòng)物模型為例，嘌呤霉素能夠直接損傷腎小球上皮細(xì)胞。當(dāng)給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（如大鼠）注射嘌呤霉素后，它會(huì)作用于腎小球上皮細(xì)胞，使細(xì)胞骨架、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、細(xì)胞表面整合素、硫酸化蛋白聚糖等物質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能變化。同時(shí)，嘌呤霉素還會(huì)誘導(dǎo)腎小球固有細(xì)胞產(chǎn)生自由基，這些自由基會(huì)進(jìn)一步破壞腎小球?yàn)V過(guò)膜，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)膜的分子屏障功能降低。因此嘌呤霉素是一款經(jīng)典的動(dòng)物腎病實(shí)驗(yàn)造模劑[2]。

三、范例詳解
1. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis.

科研人員構(gòu)建了一個(gè)熒光素酶 （Gluc） 報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，以從中藥配方SNS 中鑒定具有抗 I 型 IFN 活性的成分。并在 RAW264.7 細(xì)胞中，采用實(shí)時(shí) PCR （RT-PCR） 和 Western blotting 研究 I 型 IFN 通路的變化。此外，在博來(lái)霉素 （BLM，AbMole，M13641）誘導(dǎo)的小鼠硬化癥模型中，通過(guò) RT-PCR 測(cè)量纖維化基因、I 型 IFN 相關(guān)基因、炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，并通過(guò) H&E 染色、Masson 染色和免疫組織化學(xué)分析確定組織病理學(xué)變化。最終結(jié)果表明芍藥總葡萄糖苷 （TGP） 是 SNS 的生物活性成分，它選擇性抑制 TLR3 介導(dǎo)的 I 型 IFN 反應(yīng),并阻斷 I 型 IFN 誘導(dǎo)的下游 JAK-STAT 信號(hào)通路。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，TGP 通過(guò)抑制 I 型 IFN 信號(hào)傳導(dǎo)上游和下游的多個(gè)靶點(diǎn)來(lái)改善皮膚纖維化。在構(gòu)建熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)中，科研人員使用了由AbMole提供的Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的篩選[3]。

圖 3. Establishment of Gluc reporter assay system and identification of ingredients with anti-type I IFN activities[3].

2. Transl Oncol. 2023 Feb;28:101617.
科研人員在上述文章中探究了結(jié)直腸癌（CRC）對(duì)奧沙利鉑（Oxaliplatin，AbMole，M2290）產(chǎn)生耐受性的機(jī)制，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了KIAA1199 可以促進(jìn) CRC 的奧沙利鉑耐藥。從機(jī)制上講，KIAA1199 可以通過(guò)連接O-GlcNAc 轉(zhuǎn)移酶（OGT）和底物蛋白來(lái)促進(jìn)蛋白質(zhì)的O-GlcNAcylation ，進(jìn)而可減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 （ERS） 并防止 CRC 細(xì)胞凋亡。同時(shí)，KIAA1199 還可以通過(guò) O-GlcNAcylation穩(wěn)定SNAI1蛋白來(lái)觸發(fā)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)CRC的轉(zhuǎn)移。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，科研人員還構(gòu)建了KIAA1199和OGT敲低的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SW480 和HCT116細(xì)胞，在篩選中使用了來(lái)自AbMole的Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）[4]。

圖 4. Inhibition of PARP1 by olaparib reverses oxaliplatin resistance of CRC[4].

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參考文獻(xiàn)及鳴謝
[1] D. Zhang, Y. Gao, L. Zhu, et al., Advances and opportunities in methods to study protein translation - A review, Int J Biol Macromol 259(Pt 1) (2024) 129150.
[2] M. Xiao, B. N. Bohnert, F. Grahammer, et al., Rodent models to study sodium retention in experimental nephrotic syndrome, Acta physiologica (Oxford, England) 235(3) (2022) e13844.
[3] M. Wang, Y. Bai, D. Jiang, et al., A novel HOIP frameshift variant alleviates NF-kappaB signalling and sensitizes cells to TNF-induced death, Biochimica et biophysica acta. Molecular basis of disease 1870(7) (2024) 167355.
[4] Q. Hua, Y. Lu, D. Wang, et al., KIAA1199 promotes oxaliplatin resistance and epithelial mesenchymal transition of colorectal cancer via protein O-GlcNAcylation, Translational oncology 28 (2023) 101617.