白介素ELISA試劑盒操作步驟及問題分析
白介素ELISA試劑盒操作步驟：
1.標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。
2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品*終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。
5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7.溫育：操作同3。
8.洗滌：操作同5。
9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。
問題一：造成白介素ELISA試劑盒結(jié)果異常的原因
A、試劑盒沒有按規(guī)定進行保存，受高溫影響。
B、試劑盒、樣品用前未平衡至室溫。
C、加入試劑的體積和時間有誤，移液器計量不準，吸嘴內(nèi)水分太多或不清潔。
D、必須在有效期內(nèi)使用，超過有效期的產(chǎn)品可能會產(chǎn)生很弱的信號。
E、孵育時間及孵育溫度未達到要求，反應(yīng)板放入培養(yǎng)箱時注意溫度并及時調(diào)整。
F、洗板及加樣過程中，酶標受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力。
G、蒸餾水水質(zhì)有問題。
H、洗板次數(shù)過多，或濃縮洗液稀釋倍數(shù)不符合要求，洗滌沖擊力太大，浸泡時間太長。
I、顯色劑加量不足或順序顛倒，或混合后加入。
問題二：白介素ELISA試劑盒顯色反響應(yīng)避光運用
白介素ELISA試劑盒目視標本也無色或近于無色者判為陰性，顯色明晰者為陽性。但在ELSIA試劑盒中，正常人血清反響后常可呈現(xiàn)呈色的本底，此本底的深淺因ELISA試劑盒的構(gòu)成和試驗的條件不一樣而異，因而試驗中有必要加測陰性對照。陰性對照的構(gòu)成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類似物。在用肉眼判別成果時，更宜用顯色深于陰性對照作為標本陽性的指標。此刻酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)品。反響的溫度和時刻仍是影響顯色的要素。在必定時刻內(nèi)，陰性孔可堅持無色，而陽性孔則隨時刻的延伸而呈色加強。恰當提高溫度有助于加快顯色進行。在定量測定中，參加底物后的反響溫度和時刻應(yīng)按規(guī)則力求。ELISA試劑盒定性測定的顯色可在室溫進行，時刻通常不需要嚴格控制，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯況恰當縮短或延伸反響時刻，及時判別。
OPD底物顯色通常在室外溫或37℃反響20-30分鐘后即不再加深，ELISA試劑盒再延伸反響時刻，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反響結(jié)束時參加停止液停止反響。OPD產(chǎn)品用硫酸停止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。
TMB受光照的影響不大，ELISA試劑盒可在室溫中置于操作臺上，邊反響調(diào)查成果。但為確保試驗成果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)則的恰當時刻閱覽成果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達頂峰，隨即逐步削弱，ELISA試劑盒至2小時后即可徹底衰退至無色。TMB的停止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反響停止。這類停止劑尚能使藍色維持較長時刻(12-24小時)不褪，是目視判別的杰出停止劑。此外，各類酸性停止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色，此刻可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。
1.標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。
2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品*終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。
5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7.溫育：操作同3。
8.洗滌：操作同5。
9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。
問題一：造成白介素ELISA試劑盒結(jié)果異常的原因
A、試劑盒沒有按規(guī)定進行保存，受高溫影響。
B、試劑盒、樣品用前未平衡至室溫。
C、加入試劑的體積和時間有誤，移液器計量不準，吸嘴內(nèi)水分太多或不清潔。
D、必須在有效期內(nèi)使用，超過有效期的產(chǎn)品可能會產(chǎn)生很弱的信號。
E、孵育時間及孵育溫度未達到要求，反應(yīng)板放入培養(yǎng)箱時注意溫度并及時調(diào)整。
F、洗板及加樣過程中，酶標受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力。
G、蒸餾水水質(zhì)有問題。
H、洗板次數(shù)過多，或濃縮洗液稀釋倍數(shù)不符合要求，洗滌沖擊力太大，浸泡時間太長。
I、顯色劑加量不足或順序顛倒，或混合后加入。
問題二：白介素ELISA試劑盒顯色反響應(yīng)避光運用
白介素ELISA試劑盒目視標本也無色或近于無色者判為陰性，顯色明晰者為陽性。但在ELSIA試劑盒中，正常人血清反響后常可呈現(xiàn)呈色的本底，此本底的深淺因ELISA試劑盒的構(gòu)成和試驗的條件不一樣而異，因而試驗中有必要加測陰性對照。陰性對照的構(gòu)成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類似物。在用肉眼判別成果時，更宜用顯色深于陰性對照作為標本陽性的指標。此刻酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)品。反響的溫度和時刻仍是影響顯色的要素。在必定時刻內(nèi)，陰性孔可堅持無色，而陽性孔則隨時刻的延伸而呈色加強。恰當提高溫度有助于加快顯色進行。在定量測定中，參加底物后的反響溫度和時刻應(yīng)按規(guī)則力求。ELISA試劑盒定性測定的顯色可在室溫進行，時刻通常不需要嚴格控制，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯況恰當縮短或延伸反響時刻，及時判別。
OPD底物顯色通常在室外溫或37℃反響20-30分鐘后即不再加深，ELISA試劑盒再延伸反響時刻，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反響結(jié)束時參加停止液停止反響。OPD產(chǎn)品用硫酸停止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。
TMB受光照的影響不大，ELISA試劑盒可在室溫中置于操作臺上，邊反響調(diào)查成果。但為確保試驗成果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)則的恰當時刻閱覽成果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達頂峰，隨即逐步削弱，ELISA試劑盒至2小時后即可徹底衰退至無色。TMB的停止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反響停止。這類停止劑尚能使藍色維持較長時刻(12-24小時)不褪，是目視判別的杰出停止劑。此外，各類酸性停止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色，此刻可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。
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