譜系示蹤的難點之基因標記的異位表達如何避免？（上）

通常，細胞類型中基因的激活不是“有”或“無”，特定的基因標記意味著啟動子的活性在這種細胞類型中相對較高，而在其他細胞中，目的啟動子也可能被弱激活，這種現(xiàn)象也被叫做異位表達。異位表達對譜系追蹤的影響很大，常常會導致一些關于細胞命運的爭議。
 

圖.異位表達對譜系示蹤的影響^[1]

上一期，我們講述了雙重組酶介導的交叉報告基因類型，這種類型常用于標記雙陽性的細胞類型，而本次課程，我們來講述可以用于避免基因標記異位表達的獨家報告基因系統(tǒng)。

譜系示蹤系類課程往期回顧：
【譜系示蹤系列第一期】基礎細胞標記方式
【譜系示蹤系列第二期】單重組酶介導的多色報告系統(tǒng)方法
【譜系示蹤系列第三期】多重組酶介導的交叉報告基因方法

獨家報告基因系統(tǒng)

獨家報告基因系統(tǒng)的結構是 Promoter-site1-site2-Stop-site1-reporter A-Stop-site2-reporter B。這類系統(tǒng)是利用兩個重組系統(tǒng)，將兩對識別位點錯落的分布在兩個報告基因兩端。如果首先發(fā)生一個重組，則相應報告基因的表達將去除另一個重組系統(tǒng)的一個識別位點。換句話說，這個系統(tǒng)會防止同一細胞中發(fā)生二次重組。

獨家報告基因小鼠的基因重組，存在先后順序，可能會出現(xiàn)以下兩種情況：

情況一
A-Cre 先表達，B-DreERT2 后續(xù)通過 Tamoxifen 誘導表達。
 

當A-cre先表達時：

1 A⁺細胞：
makerA 介導 Cre 酶表達，Cre 酶會切除兩個 loxP 位點之間的序列（第一個 stop 序列與第一個 Rox 位點被切除）。該系統(tǒng)按照啟動子的方向，表達綠色熒光 ZsGreen。

2 A^- 細胞：
該系統(tǒng)未發(fā)生重組，按照啟動子的方向，遇到第一個 stop 序列被終止表達，細胞未被染色。

之后，使用 Tamoxifen 誘導 B-DreERT2 時：

1 A⁺ 細胞：
由于該系統(tǒng)中的第一個 Rox 位點被切除，無論細胞是否表達makerB，該系統(tǒng)均只表達綠色熒光 ZsGreen。

2 A^-B⁺ 細胞：
makerB 介導 Dre 酶表達，Dre 酶會切除兩個 Rox 位點之間的序列（綠色熒光 ZsGreen、第二個 Loxp 位點與第二個 stop 序列被切除），之后，該系統(tǒng)按照啟動子的方向，表達紅色熒光 tdTomato。

3 A^-B^- 細胞：
該系統(tǒng)按照啟動子的方向，遇到 stop 序列被終止表達，細胞未被染色。

因此，A⁺細胞可被標記為綠色。A^-B⁺細胞可被標記為紅色。

情況二
B-Dre 先表達，A-CreERT2 后續(xù)通過 Tamoxifen 誘導表達。

當B-Dre先表達時：
1 B⁺細胞：
makerB 介導 Dre 酶表達，Dre 酶會切除兩個 Rox 位點之間的序列（綠色熒光 ZsGreen、第二個 Loxp 位點與第二個 stop 序列被切除）。該系統(tǒng)按照啟動子的方向，表達紅色熒光 tdTomato。

2 B^- 細胞：
該系統(tǒng)未發(fā)生重組，按照啟動子的方向，遇到第一個 stop 序列被終止表達，細胞未被染色。

之后，使用 Tamoxifen 誘導 B-DreERT2 時：

1 B⁺ 細胞：
由于該系統(tǒng)中的第一個 Loxp 位點被切除，無論細胞是否表達makerA，該系統(tǒng)均只表達紅色熒光 tdTomato。

2 A⁺B^- 細胞：
makerA 介導 Cre 酶表達，Cre 酶會切除兩個 loxP 位點之間的序列（第一個 stop 序列與第一個 Rox 位點被切除）。該系統(tǒng)按照啟動子的方向，表達綠色熒光 ZsGreen。

3 A^-B^- 細胞：
該系統(tǒng)按照啟動子的方向，遇到 stop 序列被終止表達，細胞未被染色。

因此，B⁺細胞可被標記為紅色。A⁺B^-細胞可被標記為綠色。

我們使用獨家報告基因小鼠，如何避免基因標記的異位表達呢？顯然，獨家報告基因小鼠可幫助您標記 A⁺B^-（反之亦然）的細胞類型，因此，若我們想標記 MarkerA 的細胞，但 A 基因出現(xiàn)了異位表達，那我們可以利用在非目的細胞中特異性表達的 MarkerB，使用獨家報告基因系統(tǒng)將其標記為其他顏色，從而排除 MarkerA 異位表達的影響。

案例1
以 c-kit 基因為例，既往研究報道 c-kit+細胞是心肌細胞祖細胞（ECs），可能有助于心臟損傷后的新心肌細胞生成。然而，隨后的研究表明，c-kit基因也在極少數(shù)心肌細胞中表達，表明心臟損傷后追蹤的心肌細胞可能是先前標記的c-kit+心肌細胞。

但我們需要特異性靶向的c-kit+非心肌細胞，追蹤其分化命運，才能得出正確的結論。因此，我們可以使用心肌細胞特異性標記工具Tnni3-Dre將心肌細胞進行標記，之后再對c-kit+細胞進行標記，此時標記的細胞即為c-kit+非心肌細胞。

圖.獨家報告基因系統(tǒng)^[2]
 

圖.使用普通方法標記C-Kit⁺細胞無法準確標記ECs^[2]
 

點擊下圖，觀看標記圖示

圖.使用獨家報告基因系統(tǒng)先將心肌細胞標記為紅色，后將ECs標記為綠色^[2]

上述講述的是多重組酶報告基因系統(tǒng)的獨家報告基因類型，主要用于標記 A⁺B^-（反之亦然）的細胞類型，這種標記存在先后順序，相反的先后順序會極大的影響后續(xù)的標記結果。為了更加合理的控制標記細胞類型，建議兩個重組酶中一種采用可誘導類型的重組酶，從而合理控制重組發(fā)生的先后順序。

但如果您想標記的細胞類型，他在胚胎發(fā)育期 markerA 表達，但在成年后 markerA 不表達，并且表達markerB。若我們采用獨家報告基因系統(tǒng)，使用A-Cre與B-DreERT2，目的細胞仍無法成功標記。

是否存在可以使用兩個重組酶均是可誘導型的（可控制重組發(fā)生的時間），并且兩者之間的重組不會相互干擾，而且還可以成功標記 A⁺B^- 的細胞類型的報告工具鼠呢？

下一期鼠博士為大家講解多重組酶報告基因系統(tǒng)的嵌套報告基因類型。

Reference：
[1] He L, Li Y, Li Y, Pu W, Huang X, Tian X, Wang Y, Zhang H, Liu Q, Zhang L, Zhao H, Tang J, Ji H, Cai D, Han Z, Han Z, Nie Y, Hu S, Wang QD, Sun R, Fei J, Wang F, Chen T, Yan Y, Huang H, Pu WT, Zhou B. Enhancing the precision of genetic lineage tracing using dual recombinases. Nat Med. 2017 Dec;23(12):1488-1498. doi: 10.1038/nm.4437. Epub 2017 Nov 13. PMID: 29131159; PMCID: PMC6913096.

[2] Liu K, Jin H, Zhou B. Genetic lineage tracing with multiple DNA recombinases: A user's guide for conducting more precise cell fate mapping studies. J Biol Chem. 2020 May 8;295(19):6413-6424. doi: 10.1074/jbc.REV120.011631. Epub 2020 Mar 25. PMID: 32213599; PMCID: PMC7212637.

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