Cell文獻解讀:小鼠模型在發(fā)現(xiàn)軟骨再生新機制中的應(yīng)用,助力關(guān)節(jié)炎治療
2025年7月21日，同濟大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院、附屬東方醫(yī)院岳銳教授團隊聯(lián)合海南醫(yī)科大學(xué)鄒衛(wèi)國教授團隊在國際頂級學(xué)術(shù)期刊《Cell》在線發(fā)表了題為“Procr+ chondroprogenitors sense mechanical stimuli to govern articular cartilage maintenance and regeneration”的研究論文。該研究首次發(fā)現(xiàn)了對力學(xué)刺激敏感的Procr+軟骨干細胞，并證明其不僅對關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)維持至關(guān)重要，而且在關(guān)節(jié)損傷后能顯著促進軟骨細胞再生，提示其有望成為治療骨性關(guān)節(jié)炎等退行性骨關(guān)節(jié)病的新一代種子細胞。
南模生物為該研究提供了M-NSG（目錄號：NM-NSG-001）小鼠。
骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種高發(fā)的退行性關(guān)節(jié)病，全球患者已逾2.4億，其患病率與年齡高度相關(guān)：60歲以上人群中，男性達10%，女性更高達18%。該疾病以關(guān)節(jié)間隙狹窄、軟骨磨損、軟骨下骨硬化、滑膜炎、持續(xù)疼痛、關(guān)節(jié)變形及活動障礙為主要表現(xiàn)，晚期可致嚴(yán)重殘疾�，F(xiàn)有療法（如口服非甾體抗炎藥）僅能暫時緩解疼痛和炎癥，無法逆轉(zhuǎn)軟骨破壞，但嚴(yán)重病例可能需要進行全關(guān)節(jié)置換手術(shù)。
基質(zhì)相關(guān)自體軟骨細胞植入術(shù)（matrix-associated autologous chondrocyte implantation，MACI）是一種利用患者自體軟骨細胞培養(yǎng)修復(fù)軟骨缺損的治療方法，目前已獲美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)，可用于修復(fù)18~55歲患者的孤立性關(guān)節(jié)軟骨損傷。然而，自體軟骨細胞增殖能力有限，導(dǎo)致MACI術(shù)后康復(fù)周期延長且可修復(fù)區(qū)域受到限制。
成人膝關(guān)節(jié)內(nèi)，究竟哪種細胞才是關(guān)節(jié)軟骨祖細胞？以及這些細胞如何調(diào)控軟骨再生？這些問題都尚未可知。
為明確這些問題，作者進行了以下研究：
1 Procr+細胞優(yōu)先定位于脛骨關(guān)節(jié)軟骨和半月板的淺層
Procr蛋白被認為是髓核祖細胞的標(biāo)志物，然而，它是否標(biāo)記其他骨骼部位的祖細胞仍不明確。為驗證Procr+細胞是否存在于成人長骨中，作者選用 Procr-CreERT2;tdTomato 小鼠進行譜系示蹤：他莫昔芬誘導(dǎo)后，4周齡小鼠脛骨關(guān)節(jié)軟骨和半月板表層均出現(xiàn) tdTomato+信號（圖1A），股骨關(guān)節(jié)軟骨亦可見零星陽性細胞；且隨年齡增長，脛骨與半月板內(nèi)的 tdTomato+細胞數(shù)量遞減，提示 Procr+細胞在青春期更為豐富（圖1B，1C）。
Fig1. Procr+表層細胞在出生后膝關(guān)節(jié)中生成關(guān)節(jié)軟骨細胞和半月板軟骨細胞
2 Procr+淺表細胞是軟骨祖細胞，可生成關(guān)節(jié)和半月板軟骨細胞
為追蹤 Procr+淺表細胞在出生后膝關(guān)節(jié)發(fā)育中的命運，作者在4周齡Procr-CreERT2; tdTomato小鼠中給予他莫昔芬，并在1~2個月后分析其細胞命運。結(jié)果表明，除淺表層外，脛骨關(guān)節(jié)軟骨和半月板中/深層區(qū)的tdTomato+細胞數(shù)量逐漸增加（圖1D-1G）。提示Procr+細胞能夠進一步分化產(chǎn)生中層/深層關(guān)節(jié)軟骨細胞。為排除骨骼來源細胞生成關(guān)節(jié)軟骨細胞的可能性，作者利用IR1報告小鼠進行雙重重組酶譜系示蹤（圖1H）。結(jié)果顯示，在Acan-Dre; Procr-CreERT2; IR1小鼠中，關(guān)節(jié)軟骨和半月板中均未檢測到 ZsGreen+細胞（圖1I，1J），提示非骨骼來源的 Procr+細胞（如內(nèi)皮或造血干細胞）不參與出生后膝關(guān)節(jié)軟骨形成。
3 機械刺激調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨和半月板中Procr+細胞的分布和頻率
鑒于脛骨平臺比股骨遠端承受更大的機械負荷，Procr+細胞在脛骨中的優(yōu)先分布提示其可能是對機械刺激敏感的淺表細胞亞群。為驗證這一假設(shè)，作者對4周齡Procr-CreERT2; tdTomato小鼠進行為期4周的強制跑步（每天1h，圖2A）。結(jié)果顯示，跑步組小鼠股骨遠端松質(zhì)骨骨量、骨小梁數(shù)量及厚度顯著增加，骨小梁間距減小，皮質(zhì)骨面積、厚度及極慣性矩亦顯著增加。為分析跑步對Procr⁺淺表細胞的影響，作者在實驗結(jié)束時給予他莫昔芬，并于2天后分析其分布和數(shù)量。結(jié)果顯示，與對照組相比，機械刺激顯著增加了脛骨和半月板及股骨中的Procr⁺細胞數(shù)量（圖2B-2F）。
隨后，作者對4周齡Procr-CreERT2; tdTomato小鼠進行為期4周的尾部懸吊以模擬機械卸載（圖2G）。結(jié)果顯示，懸吊組小鼠股骨遠端松質(zhì)骨骨量、骨小梁數(shù)量顯著減少，骨小梁間距增加，皮質(zhì)骨厚度及極慣性矩亦顯著降低。與跑步實驗相反，尾部懸吊顯著減少了脛骨和半月板中的Procr+細胞數(shù)量，而股骨中 Procr+細胞數(shù)量極少（圖2H，2L）。以上結(jié)果提示，機械刺激對關(guān)節(jié)軟骨和半月板中Procr+細胞的分布和數(shù)量起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。
Fig2. 生理條件下 Procr+表層細胞對機械刺激敏感
4 骨關(guān)節(jié)炎激活Procr⁺軟骨祖細胞以促進關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)
骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）會顯著改變膝關(guān)節(jié)的機械負荷。為驗證OA是否調(diào)控Procr+細胞的激活與分化，作者在8周齡Procr-CreERT2; tdTomato小鼠中連續(xù)5天給予他莫昔芬，2天后通過內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)術(shù)（DMM）建立OA模型（圖3A）。結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，DMM組脛骨、股骨及半月板中/深層區(qū)的 tdTomato+軟骨細胞數(shù)量顯著增加（圖 3C，3E-3H），提示 Procr+細胞在關(guān)節(jié)軟骨損傷后被激活并分化為下游軟骨細胞。
為驗證 Procr+細胞是否對 OA 進展起保護作用，作者構(gòu)建了Procr-CreERT2; tdTomato; DTA小鼠，通過給予他莫昔芬誘導(dǎo)白喉毒素表達以特異性清除Procr+細胞（圖3B）。8周齡小鼠連續(xù)5天給予他莫昔芬，2天后行DMM手術(shù)。結(jié)果顯示，在Procr+細胞被特異性消融的小鼠中，OA相關(guān)指標(biāo)OARSI評分升高（圖3I，3J）、骨贅形成增多（圖3K，3L）。以上結(jié)果提示，OA激活Procr+軟骨祖細胞以促進關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)。
Fig3. OA激活 Procr+軟骨干細胞以促進關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)
5 Piezo1介導(dǎo)Procr+軟骨祖細胞在OA進展中的機械感應(yīng)
為進一步揭示Procr+軟骨祖細胞在OA進展中感應(yīng)機械刺激的分子機制，作者對DMM模型小鼠的關(guān)節(jié)細胞進行單細胞RNA測序（圖4A）。結(jié)果顯示，Procr+細胞中機械敏感基因Piezo1高表達，且Klf2調(diào)控的軟骨分化相關(guān)通路激活。為驗證Piezo1是否介導(dǎo)Procr+軟骨祖細胞的機械感應(yīng)，作者進行了下一步實驗。他們向DMM誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎后的 Procr-CreERT2; tdTomato小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)，每周注射Piezo/TRPV通道非特異性抑制劑 GsMTx4。結(jié)果顯示，GsMTx4顯著抑制了 DMM 后 tdTomato+軟骨細胞的生成（圖4J, 4K），并加劇了OA癥狀（圖4L, 4M）。以上結(jié)果提示，Piezo1是Procr+軟骨祖細胞感知機械刺激并修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的關(guān)鍵分子。
Fig4. Piezo1信號在OA進展中介導(dǎo)Procr+軟骨干細胞的機械感知
6 基因敲除Piezo1損害Procr+細胞激活及關(guān)節(jié)軟骨再生
為排除GsMTx4脫靶效應(yīng)，作者構(gòu)建了Procr特異性敲除Piezo1的小鼠模型（Procr-CreERT2; tdTomato; Piezo1fl/fl），DMM術(shù)后結(jié)果顯示，cKO小鼠tdTomato⁺軟骨細胞數(shù)量顯著低于對照組（圖5A，5B），OARSI評分及軟骨下骨厚度顯著增加（圖5C-5F），骨贅形成及半月板鈣化加劇（圖5G，5H）。
為驗證Piezo1在生理條件下是否調(diào)控 Procr+細胞，作者在4周齡cKO及對照小鼠中給予他莫昔芬，隨后進行4周強制跑步。結(jié)果與DMM模型一致，Piezo1缺失顯著抑制跑步誘導(dǎo)的tdTomato+軟骨細胞生成（圖 5I-5K）。綜上，Piezo1 在生理及病理條件下均為 Procr⁺細胞激活及關(guān)節(jié)軟骨再生所必需。
Fig5. Piezo1基因缺失損害Procr+細胞的激活和關(guān)節(jié)軟骨再生
7 藥理性激活Piezo1可緩解OA癥狀
為驗證Piezo1信號激活是否具有治療潛力，作者對8周齡野生型小鼠進行了DMM手術(shù)，并每周在關(guān)節(jié)腔注射Piezo1激動劑Yoda1，8周后評估OA表型。結(jié)果顯示，Yoda1以劑量依賴性方式顯著降低OARSI評分（圖6A，6B），并減少軟骨下骨厚度（圖6C，6D）。Micro-CT亦顯示360 μM Yoda1顯著抑制骨贅形成（圖6E，6F），但對半月板鈣化體積無顯著影響（圖6G，6H）。以上結(jié)果提示，關(guān)節(jié)腔內(nèi)給予Piezo1激動劑可顯著改善OA癥狀。
Fig6. 藥物激活Piezo1可緩解OA癥狀
8 Procr+細胞原位移植促進關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)
為驗證Procr+細胞能否是否可以促進軟骨的原位再生，作者進行了原位移植來修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損。作者通過流式分選了mTmG小鼠Procr+CD105+CD200+或 Procr⁻細胞，經(jīng)2D擴增、3D球體培養(yǎng)后植入缺損區(qū)（圖7J）。結(jié)果顯示，Procr+細胞組缺損區(qū)出現(xiàn)大量軟骨樣組織，Safranin O染色陽性，而Procr⁻組僅見纖維樣組織（圖7K，7L）。mTmG來源細胞的tdTomato熒光證實再生的軟骨來自供體細胞（圖7K）。
為評估人源PROCR+細胞的轉(zhuǎn)化潛力，作者從29~86歲志愿受試者關(guān)節(jié)軟骨中分選出PROCR⁺細胞，經(jīng)2D擴增、3D球體培養(yǎng)后，植入8周齡M-NSG免疫缺陷小鼠關(guān)節(jié)軟骨缺損處（由南模生物提供）。與未分選細胞相比，年輕及老年供體的PROCR⁺細胞均顯著促進軟骨再生（圖7N-7Q）。人源特異性LAMIN A/C免疫熒光證實再生軟骨為人源（圖 7N，7P，S6F）。以上結(jié)果提示，PROCR⁺細胞可作為治療關(guān)節(jié)疾病的理想軟骨祖細胞來源，或許有望突破當(dāng)前MACI技術(shù)在年齡限制上的瓶頸。
Fig7. Procr+表層細胞具有干細胞活性，移植后可高效修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損綜上所述，該研究工作在小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨和半月板淺表層中發(fā)現(xiàn)了對機械力刺激敏感的Procr+軟骨祖細胞，并證明其在出生后關(guān)節(jié)穩(wěn)態(tài)維持和損傷修復(fù)過程中能夠通過Piezo1感受機械力刺激，從而密切調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨細胞的分化與再生。此外，研究還發(fā)現(xiàn)了人類PROCR+細胞可以用于細胞治療高效再生關(guān)節(jié)軟骨。
圖8. 研究模式圖
南模生物擁有經(jīng)驗豐富的模型定制團隊，可為客戶定制敲除、條件性敲除、點突變、人源化、敲入等多種類型的基因編輯小鼠。此外，南模生物擁有含上萬種成品小鼠的模型資源庫，基本覆蓋熱門基因的敲除/條件性敲除小鼠、免疫缺陷小鼠、靶點人源化小鼠、自發(fā)疾病小鼠、Cre/Dre 工具鼠、熒光示蹤小鼠等。
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Reference：
[1] Zhu Q, Yin F, Qin J, et al. Procr+ chondroprogenitors sense mechanical stimuli to govern articular cartilage maintenance and regeneration. Cell. Published online July 17, 2025. doi:10.1016/j.cell.2025.06.036
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