DNase I酶的特性、影響活性關(guān)鍵因素及在RNA制備中的應(yīng)用與要點(diǎn)分析

DNase I 作為一種功能多樣且極為重要的酶，發(fā)揮著不可替代的作用。它能夠非特異性地對 DNA 進(jìn)行切割，最終生成 5' 端帶有磷酸基團(tuán)的二核苷酸、三核苷酸，或者寡核苷酸片段。憑借這一特性，DNase I 成為了強(qiáng)大的 DNA 操作研究工具，廣泛應(yīng)用于諸多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)流程之中

一、DNase I 單位的精準(zhǔn)界定
DNase I 的比活性是衡量其降解雙鏈 DNA 能力的關(guān)鍵指標(biāo)。在過去，其比活性多采用庫尼茨單位（Kunitz）來表示。一個(gè)庫尼茨單位的定義為：以鮭魚精子 DNA 作為底物，在 0.1M NaOAc（pH 5.0）緩沖液的特定條件下，能夠使反應(yīng)液每分鐘的吸光度增加 0.001 所需要的酶量。但值得注意的是，這種用于定義庫尼茨單位的緩沖液條件，與實(shí)際實(shí)驗(yàn)中 DNase I 消化 DNA 時(shí)所使用的典型緩沖液條件存在差異。如今，新的活性測定程序借助實(shí)時(shí)熒光分析法，能夠?qū)崿F(xiàn)對 DNase I 活性更為快速且定量的測量，為 DNase I 活性評估提供了更精準(zhǔn)的方式，進(jìn)而給出了在標(biāo)準(zhǔn)條件下更能反映其降解 DNA 能力的單位定義。

二、影響 DNase I 活性的關(guān)鍵因素
1.金屬離子的作用
DNase I 在僅含有 Mg2 + 卻不含 Ca2 + 的緩沖液環(huán)境中，實(shí)際上并不具備活性。有研究文獻(xiàn)表明，在看似不含 Ca2 + 的緩沖液中若檢測到 DNase I 存在少量活性，極有可能是由于鈣離子污染所引發(fā)的協(xié)同激活作用。Ca2 + 能夠與 DNase I 緊密結(jié)合，進(jìn)而穩(wěn)定其活性結(jié)構(gòu)。即便是處于微摩爾水平的 Ca2+，在 Mg2 + 同時(shí)存在的情況下，也能夠有效地激活 DNase I 的活性反應(yīng)。若在緩沖液中加入遠(yuǎn)低于 Mg2 + 濃度，但高于 Ca2 + 濃度的 EGTA，能夠有效抑制 DNase I 活性，抑制程度可達(dá) 1000 倍甚至更高。

2.緩沖液離子強(qiáng)度的影響
緩沖液的離子強(qiáng)度同樣是影響 DNase I 活性的重要因素之一。當(dāng)緩沖液中僅含有 Mg2 + 與 Ca2+，且不存在其他鹽類時(shí)，DNase I 能夠展現(xiàn)出最高的活性。一旦標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)緩沖液中加入的鹽（如 NaCl 或 KCl）濃度從 0 逐漸增加至 30mM，DNase I 的活性將會(huì)降低超過 2 倍。雖然在某些轉(zhuǎn)錄緩沖液中也含有一定量的鹽，但由于其中所含的 DNase I 量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過降解 DNA 模板所需的量，因此依然能夠取得較好的 DNA 降解效果。

三、DNase I 剪切作用的特異性剖析
當(dāng) DNase I 對非勻質(zhì)的雙鏈 DNA（dsDNA）進(jìn)行消化時(shí)，其產(chǎn)物主要為 60% 的雙核苷酸、25% 的三核苷酸以及少量的寡核苷酸。DNase I 能夠作用的最小片段為三個(gè)核苷酸組成的片段。盡管通常認(rèn)為 DNase I 切割 DNA 的過程不具有特異性，但深入研究發(fā)現(xiàn)，它實(shí)際上對某些序列片段存在偏好。

例如，相較于其他區(qū)域，DNase I 更容易作用于 DNA 的小溝區(qū)，并且在嘌呤 - 嘧啶序列處進(jìn)行剪切的傾向更為明顯。不過，在面對非勻質(zhì) dsDNA 時(shí)，DNase I 會(huì)對四種堿基都進(jìn)行剪切，且對任何一種特定堿基的作用程度相較于其他堿基，不會(huì)超出 3 倍以上。此外，DNase I 雖然能夠?qū)�單�?DNA（ssDNA）以及 RNA - DNA 雜交鏈中的 DNA 進(jìn)行剪切，但其活性相較于切割 dsDNA 時(shí)大大降低。例如，其剪切 ssDNA 的比活性僅約為剪切 dsDNA 比活性的五百分之一，在 RNA - DNA 雜合鏈中的活性小于作用于 dsDNA 時(shí)活性的 1 - 2% 。但由于實(shí)驗(yàn)中往往使用遠(yuǎn)高于實(shí)際需求濃度的 DNase I，所以在特定檢測條件下，其對 ssDNA 和 RNA - DNA 雜合鏈的切割程度會(huì)有所不同。

四、在 RNA 制備中去除 DNA 污染的應(yīng)用及要點(diǎn)
1.DNA 污染來源及處理需求
在 RNA 制備過程中，使用 DNase I 降解殘留的 DNA，從而將基因組 DNA 的含量控制在較低水平（低于 10µg/ml），對于避免其對后續(xù)的 RT - PCR 實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾至關(guān)重要。一次 DNase I 反應(yīng)能夠處理的 RNA 量，與樣品中 DNA 污染的程度密切相關(guān)。在進(jìn)行有機(jī)萃取，或者采用固相 RNA 純化方法時(shí)，如果二氧化硅基體過載，均有可能引入 DNA 污染。另外，從某些特定組織（如脾、腎、胸腺）以及轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中提取的 RNA，通常也更容易存在較高水平的 DNA 污染。有研究報(bào)告指出，采用 Chomcynsk 和 Sacchi 方法從腫瘤組織中提取 RNA 時(shí)，所提取的 RNA 中可能含有 7% 的 DNA，若 RNA 制備的規(guī)模較大，DNA 的量甚至可以達(dá)到微克級(jí)別。

2.實(shí)現(xiàn) DNA 完全去除的挑戰(zhàn)與策略
要實(shí)現(xiàn)將 RNA 樣品中的每一條 DNA 鏈都完全去除，幾乎是一項(xiàng)難以完成的任務(wù)。因?yàn)?RT - PCR 技術(shù)具有極高的敏感性，能夠從復(fù)雜的非勻質(zhì)混合物中擴(kuò)增單個(gè)分子。在進(jìn)行 40 次以上的 PCR 反應(yīng)循環(huán)后，即便在無逆轉(zhuǎn)錄的對照反應(yīng)中，也幾乎每次都會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增條帶，這充分表明了 DNA 污染的普遍存在。所以，在實(shí)驗(yàn)過程中，選擇最為適宜的 DNase I 消化條件以及合理設(shè)定 RT - PCR 的循環(huán)次數(shù)顯得尤為重要。為了最大程度地實(shí)現(xiàn) DNA 的完全降解，應(yīng)當(dāng)采用特定的緩沖液。同時(shí)，在進(jìn)行消化處理時(shí)，需注意不能使 RNA 濃度過高，應(yīng)先將 RNA 樣品稀釋至約 100 µg/ml 以內(nèi)再進(jìn)行操作。DNase I 的使用量也需根據(jù) DNA 污染的程度進(jìn)行合理調(diào)整。