DNA探針的來源、制備、優(yōu)勢及標記技術詳解

DNA探針是最常用的核酸探針，指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針�，F(xiàn)已獲的DNA探針種類很多，有細菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細胞DNA探針，這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。

一、DNA 探針的來源與制備

1.基因組探針
基因組探針直接來源于基因組中的基因。它可以是完整的基因序列，包含了基因的全部遺傳信息；也可能只是基因上的一段特定序列，這段序列往往具有獨特的識別價值。在獲取基因組探針時，通常依賴分子克隆技術。以細菌研究為例，由于細菌基因組龐大且復雜，包含眾多基因，為獲得特定細菌的特異性基因組探針，科研人員需要構建細菌基因組 DNA 文庫。通過限制性內(nèi)切酶對細菌 DNA 進行不完全水解，將其切成小片段后分別克隆，形成包含基因組全信息的克隆庫。隨后，利用多種其他菌種的 DNA 探針進行篩選，剔除產(chǎn)生雜交信號的克隆，最終得到的不與其他細菌雜交的克隆，就可能含有目標細菌特異性的 DNA 片段，這些片段便可作為基因組探針使用。

2.cDNA 探針
cDNA 探針的制備過程相對獨特。它以相應基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 mRNA 為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成。與基因組探針不同，cDNA 探針不包含內(nèi)含子序列，這使得它在檢測特定基因表達時更加精準。因為內(nèi)含子在基因表達調(diào)控中雖然具有重要作用，但對于直接檢測基因轉(zhuǎn)錄后的表達產(chǎn)物 mRNA 而言，去除內(nèi)含子可以避免不必要的干擾，使檢測結果更加準確地反映基因的實際表達情況。

3.寡核苷酸探針
寡核苷酸探針是在體外通過機器人工合成的小片段單鏈 DNA，其長度一般在 20 - 50 個堿基左右。盡管它相對短小，但卻具備獨特的優(yōu)勢。寡核苷酸探針穩(wěn)定性強，特異性極高，在極為嚴格的條件下進行雜交試驗時，能夠敏銳地檢測出單個堿基的突變和錯配情況。然而，由于其片段較短，攜帶的標記物數(shù)量有限，導致其敏感性相對較低。在實際應用中，科研人員會根據(jù)具體檢測需求，合理選擇寡核苷酸探針或其他類型的探針。

二、DNA 探針的顯著優(yōu)勢

1.制備簡便
DNA 探針大多克隆在質(zhì)粒載體中，這種克隆方式使得 DNA 探針的制備過程相對簡便。質(zhì)粒作為一種常用的基因載體，具有自我復制能力和易于操作的特點。科研人員可以將目標 DNA 片段插入到質(zhì)粒載體中，然后通過轉(zhuǎn)化等技術將重組質(zhì)粒導入合適的宿主細胞（如大腸桿菌）中。隨著宿主細胞的生長繁殖，質(zhì)粒載體攜帶的 DNA 探針也會大量復制，從而方便地獲取大量的 DNA 探針，滿足實驗和檢測的需求。

2.穩(wěn)定性高
與 RNA 探針相比，DNA 探針具有更高的穩(wěn)定性，能夠有效抑制 DNA 酶的活性。在生物體內(nèi)和體外實驗環(huán)境中，核酸酶普遍存在，它們會對核酸分子進行降解，影響檢測結果的準確性。RNA 探針由于其單鏈結構和核糖的化學性質(zhì)，更容易受到 RNA 酶的攻擊而降解。而 DNA 探針的雙鏈結構以及脫氧核糖的穩(wěn)定性，使其在面對 DNA 酶時具有更強的抵抗力，能夠在較長時間內(nèi)保持結構和功能的完整性，為實驗的順利進行提供了可靠保障。

3.標記成熟
DNA 探針的標記技術較為成熟，有同位素標記和非同位素標記兩種主要方式，每種方式又包含多種具體的標記方法，為科研人員提供了豐富的選擇。同位素標記的探針具有很高的放射比活性，這使得雜交檢測的靈敏度極高，能夠檢測到微量的目標核酸序列。然而，同位素標記也存在一些局限性，如使用期限較短、具有放射性危害、污染物處置困難等，需要特殊的儀器設備和嚴格的防護措施，限制了其在普通實驗室的應用。近年來，非同位素標記法得到了快速發(fā)展，像酶促標記法（如生物素、地高辛標記法）和化學標記法（如熒光生物素、酶標記法）等。這些非同位素標記的探針雖然在靈敏度上稍遜于同位素標記探針，但它們保存時間較長，且避免了同位素帶來的污染問題，在實際應用中也得到了廣泛的使用。

三、DNA 探針的標記技術詳解

1.缺口平移法
缺口平移法是 DNA 探針標記中最常用的方法之一。該方法的反應體系主要包含 DNA 酶 I、大腸桿菌 DNA 聚合酶 I、三種三磷酸脫氧核糖核苷酸以及一種同位素標記的核苷酸（如 ³²P - dGTP）。在反應過程中，首先利用適當濃度的 DNA 酶 I 在探針 DNA 雙鏈分子上隨機切開若干個缺口，但并不會切斷 DNA 或使其降解。接著，借助 DNA 聚合酶 I 的 5'→3' 外切酶活性，切去 5’末端的核苷酸；同時，利用其 5’→3’聚合酶活性，將 ³²P 標記的互補核苷酸補入缺口。這兩種活性交替作用，使得缺口不斷向 3’的方向移動，DNA 鏈上的核苷酸逐漸被 ³²P 標記的核苷酸所取代。最終，新合成的 DNA 鏈帶有同位素標記，實現(xiàn)了對 DNA 探針的標記。

2.隨機引物法
隨機引物法的操作相對簡便且高效。在變性的探針溶液中加入 6 個核苷酸的隨機 DNA 小片段作為引物，這些引物能夠與單鏈 DNA 的多個部位互補結合。然后，按照堿基互補原則，在引物的 3'-OH 端不斷添加同位素標記的單核苷酸。通過這種方式，可以獲得放射性比活性很高的 DNA 探針。隨機引物法的優(yōu)勢在于，它不受 DNA 模板序列的限制，能夠在多種不同的 DNA 模板上進行標記，適用于各種復雜的基因檢測場景。

3.末端標記法
末端標記法與前兩種方法不同，它并非對 DNA 進行全長標記，而是只在其 5' 端或 3’端導入標記物進行部分標記。具體操作時，先利用限制性內(nèi)切酶將完整雙鏈 DNA 切割成具有末端突出的 DNA 片段，然后使用 Klenow DNA 聚合酶和 α - ³²P - dNTP 對末端進行標記。這種標記方法的優(yōu)點是可以得到全長 DNA 探針，但由于攜帶的標記分子較少，標記比活性相對不高。在一些對標記比活性要求不高，但需要保留 DNA 全長信息的實驗中，末端標記法具有獨特的應用價值。

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