Puromycin(嘌呤霉素)的作用機制及在轉(zhuǎn)染篩選、動物造模中的應用

Puromycin（嘌呤霉素）是一種由白黑鏈霉菌（Streptomyces alboniger）產(chǎn)生的氨基核苷類抗生素，Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）也是一種常用的蛋白質(zhì)合成抑制劑，多用于轉(zhuǎn)染篩選、蛋白翻譯研究、動物造模等實驗。AbMole為全球科研客戶提供高純度、高生物活性的抑制劑、細胞因子、人源單抗、天然產(chǎn)物、熒光染料、多肽、靶點蛋白、化合物庫、抗生素等科研試劑，全球大量文獻專利引用。

一、Puromycin(嘌呤霉素)的作用機制

在細胞內(nèi)，蛋白質(zhì)的合成是一個極其復雜且高度有序的過程，而Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）就如同一個 “搗亂分子”可以干擾這一關(guān)鍵進程。它的作用靶點主要是核糖體，通過模擬氨�；� tRNA（aa-tRNA）的 3' 末端結(jié)構(gòu)，巧妙地混入蛋白質(zhì)合成的 “生產(chǎn)線” 中。正常情況下，氨�；� tRNA 攜帶特定的氨基酸進入核糖體的 A 位點，參與肽鏈的延伸。而嘌呤霉素由于其結(jié)構(gòu)與氨�；痶RNA的3'末端極為相似，能夠以假亂真，代替正常的氨基酸進入核糖體。一旦PuromycinPuromycin（嘌呤霉素）進入核糖體的A位點，核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶中心（PTC）就會將其催化摻入到新生肽鏈的C末端。然而，嘌呤霉素畢竟不是真正的氨基酸，它無法像正常的氨�；� tRNA 那樣參與后續(xù)的肽鏈延伸反應。這就如同在一條生產(chǎn)線上，突然混入了一個不符合標準的零件，導致整個生產(chǎn)流程被迫中斷，翻譯過程過早終止[1]。
 

 圖 1. Puromycin的作用機理[1]

二、應用領(lǐng)域
1. 抗性篩選
細胞轉(zhuǎn)染是指將外源核酸（如 DNA、RNA 等）導入真核細胞內(nèi)的過程�？蒲腥藛T通常可將含有抗嘌呤霉素的基因（如 pac 基因，編碼嘌呤霉素N-酰轉(zhuǎn)移酶）的載體與目的基因重組后轉(zhuǎn)入宿主細胞中。pac可乙�；�Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637），使其失去對蛋白質(zhì)合成的抑制活性，從而賦予細胞對嘌呤霉素的抗性。通過在細胞培養(yǎng)基中加入Puromycin，實驗人員可以通過篩選獲得成功轉(zhuǎn)染的細胞。在具體操作中需進行預實驗以確定最佳篩選濃度。2014年，AbMole的兩款抑制劑分別被西班牙國家心血管研究中心和美國哥倫比亞大學用于動物體內(nèi)實驗，相關(guān)科研成果發(fā)表于頂刊 Nature 和 Nature Medicine。

2. 蛋白質(zhì)翻譯研究

翻譯水平的調(diào)節(jié)是重要的基因表達調(diào)控機制之一，涉及mRNA 翻譯因子、核糖體蛋白、RNA 結(jié)合蛋白和非編碼 RNA 的表達以及 RNA 二級結(jié)構(gòu)、RNA甲基化和上游開放閱讀框選擇的調(diào)節(jié)變化。Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）是一種研究蛋白翻譯的重要工具，當在細胞培養(yǎng)體系中以低濃度加入嘌呤霉素時，它能夠特異性地摻入到新合成的肽鏈中。這一過程就像是給上述肽鏈貼上了一個特殊的“標簽”，科研人員可以通過追蹤這個 “標簽” 來了解蛋白質(zhì)合成的動態(tài)過程，通過可以特異性識別Puromycin的抗體進行免疫印記和免疫熒光等方式檢測蛋白翻譯的動態(tài)過程。此外，基于嘌呤霉素的檢測與鄰位連接 （PLA） 檢測的結(jié)合（Puro-PLA），實驗人員可以檢測特異性 mRNA 的翻譯。Puro-PLA：目的蛋白抗體和Puromycin的抗體各帶有一段可以互補的核苷酸序列，當Puromycin作用于目的肽鏈上時，與目的蛋白的新生肽鏈間距較近，隨后加入上述兩種抗體，此時上述的兩段核苷酸就會互補配對，隨后通過滾環(huán)擴增（RCA）產(chǎn)生可檢測的信號。

圖 2. Puro-PLA的工作原理

3. 構(gòu)建動物腎病模型
Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）在構(gòu)建動物模型，尤其是腎病模型方面，有著重要的應用。以構(gòu)建腎病動物模型為例，嘌呤霉素能夠直接損傷腎小球上皮細胞。當給實驗動物（如大鼠）注射嘌呤霉素后，它會作用于腎小球上皮細胞，使細胞骨架、細胞外基質(zhì)蛋白、細胞表面整合素、硫酸化蛋白聚糖等物質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能變化。同時，嘌呤霉素還會誘導腎小球固有細胞產(chǎn)生自由基，這些自由基會進一步破壞腎小球濾過膜，導致腎小球濾過膜的分子屏障功能降低。因此嘌呤霉素是一款經(jīng)典的動物腎病實驗造模劑[2]。

三、范例詳解
1. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis.

科研人員構(gòu)建了一個熒光素酶 （Gluc） 報告基因檢測系統(tǒng)，以從中藥配方SNS 中鑒定具有抗 I 型 IFN 活性的成分。并在 RAW264.7 細胞中，采用實時 PCR （RT-PCR） 和 Western blotting 研究 I 型 IFN 通路的變化。此外，在博來霉素 （BLM，AbMole，M13641）誘導的小鼠硬化癥模型中，通過 RT-PCR 測量纖維化基因、I 型 IFN 相關(guān)基因、炎性細胞因子的表達，并通過 H&E 染色、Masson 染色和免疫組織化學分析確定組織病理學變化。最終結(jié)果表明芍藥總葡萄糖苷 （TGP） 是 SNS 的生物活性成分，它選擇性抑制 TLR3 介導的 I 型 IFN 反應,并阻斷 I 型 IFN 誘導的下游 JAK-STAT 信號通路。在動物實驗中，TGP 通過抑制 I 型 IFN 信號傳導上游和下游的多個靶點來改善皮膚纖維化。在構(gòu)建熒光素酶檢測系統(tǒng)中，科研人員使用了由AbMole提供的Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）用于細胞轉(zhuǎn)染后的篩選[3]。

圖 3. Establishment of Gluc reporter assay system and identification of ingredients with anti-type I IFN activities[3].

2. Transl Oncol. 2023 Feb;28:101617.
科研人員在上述文章中探究了結(jié)直腸癌（CRC）對奧沙利鉑（Oxaliplatin，AbMole，M2290）產(chǎn)生耐受性的機制，在實驗中發(fā)現(xiàn)了KIAA1199 可以促進 CRC 的奧沙利鉑耐藥。從機制上講，KIAA1199 可以通過連接O-GlcNAc 轉(zhuǎn)移酶（OGT）和底物蛋白來促進蛋白質(zhì)的O-GlcNAcylation ，進而可減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 （ERS） 并防止 CRC 細胞凋亡。同時，KIAA1199 還可以通過 O-GlcNAcylation穩(wěn)定SNAI1蛋白來觸發(fā)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進CRC的轉(zhuǎn)移。在實驗設(shè)計中，科研人員還構(gòu)建了KIAA1199和OGT敲低的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SW480 和HCT116細胞，在篩選中使用了來自AbMole的Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）[4]。

圖 4. Inhibition of PARP1 by olaparib reverses oxaliplatin resistance of CRC[4].

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參考文獻及鳴謝
[1] D. Zhang, Y. Gao, L. Zhu, et al., Advances and opportunities in methods to study protein translation - A review, Int J Biol Macromol 259(Pt 1) (2024) 129150.
[2] M. Xiao, B. N. Bohnert, F. Grahammer, et al., Rodent models to study sodium retention in experimental nephrotic syndrome, Acta physiologica (Oxford, England) 235(3) (2022) e13844.
[3] M. Wang, Y. Bai, D. Jiang, et al., A novel HOIP frameshift variant alleviates NF-kappaB signalling and sensitizes cells to TNF-induced death, Biochimica et biophysica acta. Molecular basis of disease 1870(7) (2024) 167355.
[4] Q. Hua, Y. Lu, D. Wang, et al., KIAA1199 promotes oxaliplatin resistance and epithelial mesenchymal transition of colorectal cancer via protein O-GlcNAcylation, Translational oncology 28 (2023) 101617.